| 研究課題/領域番号 |
20K05846
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| 研究機関 | 横浜国立大学 |
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研究代表者 |
武田 穣 横浜国立大学, 大学院工学研究院, 教授 (40247507)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | Sphaerotilus montanus / マイクロチューブ / チオペプチドグリカンリアーゼ |
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| 研究実績の概要 |
有鞘細菌は糸状に連なった細胞列を包み込むマイクロチューブ（鞘）を形成する。鞘は多数の細胞の連携によって細胞外で形成される秩序だった微細構造体である。本研究では、積層造形方式の3Dプリンターのように末端でのみ伸長する多糖系の鞘を持つSphaerotilus属に着目する。末端部のみでの伸長するためには、損傷した血管が止血に至る機構に類似した、しかし極めて単純な仕組みによる可溶性高分子（マイクロチューブ形成高分子前駆体）の微小領域での不溶化（マイクロチューブ形成高分子への成熟）が進行していると考えられる。いかなる可溶性高分子が、いかなる変化を受けて凝集し形体を成しえるのかを明らかにすれば、水溶性高分子を素材とする水中での微細造形技術の開発に展開できる。
今年度は、滑走路排水系から単離したSphaerotilus montanusのマイクロチューブを主たる研究対象として、マイクロチューブをもたらす高分子の化学構造を明らかにし、特に修飾状態（アセチル化など）と高分子の挙動（凝集性）との関連を明らかにすることを目標として研究を行った。構造決定においては、脱アセチル状態のアミノ糖残基に特異性を示す新規性の高い多糖リアーゼ（チオペプチドグリカンリアーゼ）を用いた。マイクロチューブを本酵素で分解して得た断片（オリゴ糖）と、マイクロチューブの化学的処理で得た可溶化物（多糖）の構造決定をNMR分光法と質量分析法によって試みた。その結果、両試料の構造決定に至り、S. montanusのマイクロチューブ形成高分子が両性多糖であることが判明するとともに、チオペプチドグリカンリアーゼがガラクトサミンとグルクロン酸の間のグリコシド結合を特異的に認識することを確かめた。さらにマイクロチューブの部分分解と化学修飾によって、適切なO-およびN-アセチル化がマイクロチューブ形成に必要であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マイクロチューブ形成においては、マイクロチューブ形成高分子の化学構造は当然ながら、その修飾状態（特にアセチル化状態）の制御が重要と予想し、その真偽を確かめるのが主たる目標である。これに加え、新規性が高いながら新規EC番号の付与に至っていないマイクロチューブ分解酵素（チオペプチドグリカンリアーゼ）の認証に足る客観的データ（例えば基質特異性）を示すこともあわせて目標に設定している。
令和2年度には下記の成果が得られた。①蛍光顕微鏡観察により、Sphaerotilus montanusのマイクロチューブが積層造形によって形成されることを確認した。②マイクロチューブ形成高分子の構造決定に至り、同細菌のマイクロチューブは既知のSphaerotilus属細菌のマイクロチューブ（ペプチド系複合糖質）とはことなり、アミノ酸を含まない純然たる多糖であることを見出した。既知のマイクロチューブ形成高分子よりも単純な構造ゆえに、生物学的積層造形機構の解明に適した研究対象と考えられる。②S. montanusの鞘形成高分子は部分O-およびN-アセチル化された両性多糖（陽性解離基と陰性解離基の数が同じの両性多糖）で、脱O-, N-アセチル化すると（塩基性多糖にすると）可溶性に、脱O-アセチル化したうえで完全N-アセチル化しても（酸性多糖にしても）可溶性になることが判明した。③チオペプチドグリカンリアーゼがS. montanusのマイクロチューブに作用することを確かめ、さらに生じた断片（オリゴ糖）の構造決定を行った。そして、同酵素がガラクトサミンとグルクロン酸の間のグリコシド結合を認識すること、N-アセチルガラクトサミンとグルクロン酸の間のグリコシド結合はほとんど認識しないことを確認した。
このような成果が得られたことから、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
細菌による細胞外での積層造形に関する理解を深めるべく、おしなべて末端伸長型すると思しきSphaerotilus 属および近縁のLeptothrix属のマイクロチューブの多様性を把握することが有意義である。そこで、これまでマイクロチューブの分析が行われていなかったSphaerotilus 属株に着目すべきと考えている。マイクロチューブ（マイクロチューブ形成高分子凝集体）の安定性（変性剤耐性、耐熱性など）にはアセチル基をはじめとする置換基の影響が大ききことがわかりはじめている。類似の化学構造を有しながら安定性の異なるマイクロチューブを比較すれば置換基の役割を解明できるはずである。安定性を司る可能性のある部分構造が絞り込めれば計算化学的な手法での検証によって寄与の機構を推定できると思われる。さらに、すでに明らかになっている一つのマイクロチューブ形成遺伝子（糖転移酵素遺伝子）を手掛かりとして各株のゲノム解析を行えば、同遺伝子の具体的な役割が推察できると察せられる。余力があれば、Sphaerotilus 属に限定せずマイクロチューブの分析および関連遺伝子の解析を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
投稿論文作成（査読後の修正原稿の作成）のための英文校正を年度内に予定していたが、査読が長引き英文校正が翌年度にずれ込んだ。このため、英文校正用の予算を翌年度に請求することとした。
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