プロテオーム解析を用いた直接的アプローチ法による薬剤標的同定解析システムの開発

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K05857
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 室井 誠 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 専任研究員 (30261168)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: プロテオミクス / 生理活性物質 / 標的分子同定 / ケミカルバイオロジー

研究実績の概要

(I) CETSAとChemProteoBaseを組み合わせた上記のシステム(２DE-CETSA)の構築：化合物が標的タンパク質に結合する時に熱安定性を変化させることを利用したセルサーマルシフトアッセイ（CETSA）法と２次元電気泳動（２DE）に基づくプロテオーム解析を組み合わせた新規の標的タンパク質解析法の2DE-CETSAの開発に着手し、その実用の可能性を示した（Cell Chem Biol, 27:186-196e, 2020）。その後、新規化合物などに応用するために、測定データからZスコアーの計算、並びに、各スポットのメルティングカーブの作成などを行うなど、計算基盤を整えた。
(II) ２DE-CETSAを用いた新規化合物の解析による解析系の有用性の証明：がん細胞の増殖阻害を指標にスクリーニングで得られた、標的分子の知られていない活性物質について２DE-CETSAを用いた解析を行い、標的の候補となるタンパク質を見出している。また、関連したプロテオーム解析技術を利用して、新規作用が予測される化合物NPD9055を見出し、MSを用いたケミカルプロテオミクスを用いて結合タンパク質の解析を行った。その結果、NPD9055が3量体Giタンパク質に結合し、調節化合物として働くことが示された（Biosci. Biotechnol. Biochem. 84: 2484-2490, 2020)。この他、、Miclxin はMIC60に結合し、β-カテニン変異がん細胞にミトコンドリアストレスを介してアポトーシスを誘導すること (ACS Chem. Biol. 15：2195-2204, 2020)、並びに、シロイヌナズナとイネの塩耐性を増強する化合物FSL0260が複合体Iに結合するが明らかとなった（Sci. Rep. 10:8691, 2020)。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2-D DIGEを利用した新しい解析系2DE-CETSAの実用の可能性を示すことができた。取得データを解析する計算基盤の整備も順調に進んでいる。さらに、新規生理活性物質の解析に取りかかれたことは、予想以上に計画が進んでいることを示している。さらに、解析系の最適化を進めることで、生理活性物質の迅速な標的解析が可能となることが期待される。

今後の研究の推進方策

（１）昨年度に続き、2DE-CETSAのデータの解析基盤を改良することによって、より迅速な解析を可能とするシステムを構築する。
（２）2DE-CETSAの解析はHeLa細胞で行なっているが、他の細胞や植物などの他の細胞にも拡張が可能である。シロイヌナズナなどの培養細胞を用いて2DE-CETSA法を検討する。
（３）2DE-CETSAの解析の有用性を示すためには、標的未知化合物の標的分子を、本解析法を用いて明らかにすることが必要である。そのため、現在解析中の化合物を含め、新規化合物の解析を進め、その標的標的分子候補となるスポットを選び、バリデーション実験を行う。

次年度使用額が生じた理由

コロナ禍もあり、実験遂行上の遅延がおこったため。

研究成果

• [国際共同研究] マックス・プランク研究所(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: マックス・プランク研究所
• [国際共同研究] 浙江大学(中国)
  • 国名: 中国
  • 外国機関名: 浙江大学
• [雑誌論文] Interaction between goniothalamin and peroxisomal multifunctional enzyme type 2 triggering endoplasmic reticulum stress (2020)
  • 著者名/発表者名: 15)Sophonnithiprasert, T., Aruksakunwong, O., Tashiro, E., Kondoh, Y., Muroi, M., Osada, H., Imoto, M., Watanapokasin, R.
  • 雑誌名: Heliyon 巻: 6 ページ: e05200
  • DOI: 10.1016/j.heliyon.2020.e05200
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Discovery of small-molecule modulator of heterotrimeric Gi-protein by integrated phenotypic profiling and chemical proteomics (2020)
  • 著者名/発表者名: 16)Kawamura, T., Futamura, Y., Shang, E., Muroi, M., Janning, P., Ueno, M., Wilke, J., Takeda, S., Kondoh, Y., Ziegler, S., Watanabe, N., Waldmann, H., Osada, H.
  • 雑誌名: Biosci. Biotechnol. Biochem. 巻: 84 ページ: 2484～2490
  • DOI: 10.1080/09168451.2020.1812375
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Miclxin, a novel MIC60 inhibitor, induces apoptosis via mitochondrial stress in β-catenin mutant tumor cells. (2020)
  • 著者名/発表者名: 20)Ikeda, H., Muroi, M., Kondoh, Y., Ishikawa, S., Kakeya, H., Osada, H., Imoto, M.
  • 雑誌名: ACS Chem. Biol. 巻: 15 ページ: 2195～2204
  • DOI: 10.1021/acschembio.0c00381
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inhibition of mitochondrial complex I by the novel compound FSL0260 enhances high salinity-stress tolerance in Arabidopsis thaliana (2020)
  • 著者名/発表者名: 23)Sako, K., Futamura, Y., Shimizu, T., Matsui, A., Hirano, H., Kondoh, Y., Muroi, M., Aono, H., Tanaka, M., Honda, K., Shimizu, K., Kawatani, M., Nakano, T., Osada, H., Noguchi, K., Seki, M.
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 10 ページ: 8691
  • DOI: 10.1038/s41598-020-65614-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of a small compound targeting PKM2-regulated signaling using 2D gel electrophoresis-based proteome-wide CETSA. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nagasawa I, Muroi M, Kawatani M, Ohishi T, Ohba SI, Kawada M, Osada H.
  • 雑誌名: Cell Chemical Biology 巻: 27 ページ: 186～196.e4
  • DOI: 10.1016/j.chembiol.2019.11.010
  • 査読あり
• [図書] マウス・ラットモデル作製・解析プロフェッショナル (2021)
  • 著者名/発表者名: 先端モデル動物支援プラットフォーム（AdAMS）
  • 総ページ数: 320
  • 出版者: 羊土社
  • ISBN: 978-4-7581-2112-5
• [備考] 理化学研究所 環境資源科学研究センター ケミカルバイオロジー 研究グループ
  • URL: http://www.cbrg.riken.jp/csrs/ja/