| 研究課題/領域番号 |
20K05876
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
桂田 直子 神戸大学, 医学研究科, 助教 (30816195)
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| 研究分担者 |
西村 善博 神戸大学, 医学部附属病院, 名誉教授 (20291453)
小林 和幸 神戸大学, 医学部附属病院, 特命教授 (50403275)
永野 達也 神戸大学, 医学研究科, 講師 (80624684)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 食物アレルギー |
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| 研究実績の概要 |
レタスはキク科の植物で職業性喘息、アナフィラキシー、花粉-食物アレルギー症候群等の原因となるが、その診断のための感度・特異度の高い検査は現時点では存在せず、減感作療法も確立していない。申請者はこれまでに質量分析装置を用いて、レタスによる職業性呼吸器アレルギーの原因抗原の同定に成功している。
レタスの葉、茎をそれぞれ200 gずつ-60℃のアセトンでホモジナイズし、遠心分離して凍結乾燥させ、PBSに溶解させる。一晩4℃で撹拌して抽出処理を行った後、遠心分離し、上澄み液を回収し、0.1 Mの炭酸水素アンモニウム液で分離し、凍結乾燥させ、PBSに溶解する。
上記で作成したレタス抽出液5 µgを4% SDS、20%グリセオール、10%2β-メルカプトエタノール、0.02%BPB入りの0.1 M Trisバッファーと混ぜ、マーカーと共にポリアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動して分子量に従いタンパクを分離する（SDS-PAGE）。次に分離したタンパクをニトロセルロース膜に電気的に転写する（イムノブロッティング法）。膜を室温で2時間ブロッキングした後、150 mM塩化ナトリウム、5 mM EDTA、0.05% Triton X-100、50 mM Trisバッファー（pH 8.8）で10倍希釈した患者血清と4℃で一晩反応させる。その後、HRPで標識した抗ヒトIgE抗体で1時間反応させ、蛍光を解析する。これらの方法により、今回新たに17 kDaのタンパクを新規レタス抗原として同定した。
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