| 研究課題/領域番号 |
20K05971
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
木藤 新一郎 名古屋市立大学, 大学院理学研究科, 教授 (60271847)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | プラスミドの構築 / 形質転換植物の作成 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度は、申請時に計画した３つの研究（１．オオムギCISP遺伝子を過剰発現させた形質転換植物の作出、２．CISPの発現・局在解析、３．CISPの修飾解析と相互作用因子の探索）に取り組んだ。
研究１に関しては、形質転換植物の作出に使用するプラスミド（CISP in pRI101-ANとCISP in pRI101-ON）の構築が完了し、アグロバクテリウム法でシロイヌナズナとイネに導入している。現在の所、シロイヌナズナでは２系統の形質転換体が作出できているが、イネについては選抜や再分化に時間を要するため、形質転換体の作成には至っていない。作出した形質転換シロイヌナズナ（CISP過剰発現系統）は、低温下での生育状況等を非形質転換体と比較し、CISPの発現が低温耐性等に与える影響を調べる実験に使用する。
次に研究２に関しては、CISPのアミノ酸配列（４箇所）に対するペプチド抗体を作成し、その内の１つ（N末端のアミノ酸配列に対する抗体）がCISPを特異的に認識することをWestern blot法で確認できている。また、抗体の作成に失敗した場合に備えて各種タグを融合させたCISPを植物体で発現させるためのプラスミド（CISP-GFP in pRI101-ANやCISP-FLAG in pRI101-ANなど）の構築を進めていたが、それらプラスミドの構築も完了している。よって、今年度からCISPの発現と局在を組織や細胞レベルで調べるための準備が整った。
最後に研究３に関しては、解析に使用するCISPの抗体を研究２で作成し、さらに酵母Two-Hybrid法でCISPの相互作用因子をスクリーニングするためのプラスミド（CISP in pGBT9）も構築した。よって、今年度から免疫沈降法と酵母Two-Hybrid法を用いてCISPの相互作用因子を探索する準備も整った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度は、今後の研究に使用するプラスミドの構築や作成したプラスミドを使った形質転換植物（シロイヌナズナとイネ）の作成、そしてCISPの発現・局在解析と相互作用因子の探索に利用する抗体の作成に取り組んだ。
各種プラスミドは、既存の実験手法で問題なく構築できている。また、形質転換植物はシロイヌナズナで２系統できており、低温耐性の評価に着手できることから順調に進んでいると判断できる。ただし、実験結果の信頼性を上げるため、実験に使用する形質転換シロイヌナズナの作出は現在も続けている。イネについては作出に時間がかかっているが、今年度中には形質転換体が得られると考えている。
CISP抗体の作成については、複数作成したペプチド抗体の内、N末端側のアミノ酸配列を抗原にして作成した抗体がCISPを特異的に認識することが確認できており、CISPの発現・局在解析や相互作用因子の探索を実施するため準備が整った。
以上のことから、研究は概ね順調に進んでいると判断できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度は、研究に使用する各種形質転換体を作成するためのプラスミドや抗体などの作成に取り組み、概ね予定通りに進めることができた。
本研究の主たる目的は、冬季にオオムギの根で特異的に発現するCISPタンパク質が根の低温順化に関わっていることを検証・証明することであり、その為にCISPを過剰発現させた形質転換植物（シロイヌナズナやイネ）の作成に取り組んでいる。作成は順調に進んでいるので、植物体が完成次第、それらの低温耐性（低温順化処理せずに低温に移した後の低温耐性が非形質転換体と比較して異なるか等）を詳細に調べていく計画である。
また、本研究ではCISPが低温耐性を誘導する作用機構を解明することも目的としており、その為にCISPの発現・局在やCISPの修飾、そして相互作用因子の有無などを調べる計画である。これらの解析を行うためにはCISPタンパク質を特異的に認識する抗体やCISPを発現させた各種形質転換体が必要となるが、抗体は初年度に準備できている。よって今後は、作成した抗体を使ったCISPの発現・局在解析に着手する計画である。また、抗体を利用して免疫沈降実験を行い、CISPと細胞内で相互作用していると期待される因子の探索も行う計画である。なお、CISPの抗体が入手できたため、当初計画していたタマネギの表皮でCISP-GFPを一過的に発現させてCISPの細胞内局在を観察する実験は、実施しないこととする。
本研究では、CISPとGFPを共発現する形質転換植物を使用してCISPがGFPの翻訳活性に及ぼす影響を調べる計画であるが、形質転換体を作出するために使用するプラスミドの構築はすでに完了しており、今年度から、それらプラスミドを用いた形質転換体の作出に着手する計画である。
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