| 研究課題/領域番号 |
20K05971
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
木藤 新一郎 名古屋市立大学, 大学院理学研究科, 教授 (60271847)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 低温耐性 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度は、CISPを過剰発現させた形質転換シロイヌナズナ（１系統）を使用し、低温耐性に関わる形質評価（低温順化処理せずに低温に移した後の低温耐性が非形質転換体と比較して異なるか等）を実施した。具体的には、シロイヌナズナ（非形質転換体と形質転換体）を低温順化させずに氷点下に1日放置し、常温に戻した後の生存率を調べた。その結果、非形質転換体が枯死したのに対して、CISP遺伝子を発現する形質転換体は枯死しない個体が複数見られ、低温耐性が上がっていることが確認できた。使用した個体数が十分でなく明確な結論を出すには至っていないが、CISPが植物の低温耐性に寄与することを示唆する期待通りの結果が得られた。
次に、発現解析では、CISPのmRNAsが根で高発現していることや、その局在が根端や側根の分裂組織であることを明らかにした。しかし、タンパク質レベルの発現解析ではCISPに特異的なシグナルを検出することができておらず、結果が得られていない。その理由として、CISPを検出するために作成した抗体に問題がある可能性もあるが、現時点では、CISPが非常に不安定で分解され易いタンパク質であるために検出できないと考えている。また、CISPとGFPを共に発現する形質転換体の作成については遅れているため、今年度も引き続き形質転換体の作成を進める計画である。
最後にCISPの修飾や相互作用因子の探索に関する研究については、Western blot法でオオムギのCISPが検出できないことから、修飾の有無については解析が進んでいない。そこで、CISPと相互作用する因子の探索を酵母ツーハイブリッド法で行ったが、手持ちのcDNAライブラリーを完全に網羅する数のクローンをスクリーニングしても候補は得られてなかった。よって、CISPは単独で機能するタンパク質である可能性が高いと、現時点では考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度は、CISPを高発現する形質転換シロイヌナズナを用いて低温耐性の評価を実施し、CISPの発現でシロイヌナズナの低温耐性が上がる（低温順化させなくても、低温耐性の形質を獲得している）ことを明らかとした。本研究は、CISPが低温耐性に関わるという仮説を検証して証明することを主目的の一つとしているため、シロイヌナズナの解析では非常に重要な結果が得られたと考えている。一方、形質転換イネを用いた解析は遅れているが、今年度中にはCISPを発現するイネを用いて低温耐性に関わる形質評価ができるため、その結果次第で当初の研究目的が十分に達成できると期待している。
次に、mRNAsの発現解析では、低温下で発現誘導されるCISPのmRNAsが常温では非常に不安定で迅速に分解されていることを示唆するデータが得られ、CISPの機能（作用メカニズム）を考える上で参考となる興味深いデータも得られている。また、仮にCISPタンパク質が当初考えていた通り低温下での翻訳活性を維持するために細胞内に運ばれたmRNAsに結合して分子内で二次構造が形成されるのを阻止するRNAシャペロンである場合、常温下ではCISPが不要となるため選択的に分解されていると推察されるが、その可能性を支持するような結果（CISPタンパク質は非常に不安定で検出できない）も得られている。
一方、CISPが不安定なためタンパク質レベルの解析や免疫沈降法による相互作用因子の探索は進んでいないが、後者に関しては別の手法（酵母ツーハイブリッド法）で探索を進め、CISPには相互作用因子が存在せず単独で機能するタンパク質であることを示唆する結果を得ている。
以上の結果を総合的に判断し、研究は概ね順調に進んでいると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、CISPを過剰発現させた形質転換植物を用いた低温耐性の評価を実施する計画である。昨年度にCISPを発現するシロイヌナズナの低温耐性が上昇する傾向が見られたことから、今年度は個体数を増やして同様の解析を行うとともに、複数の形質転換系統を用いてCISPの発現がシロイヌナズナの低温耐性に寄与することを明確に示すデータを得る。また、現在作成している形質転換イネを用いて同様の解析を行い、CISPが植物の低温耐性に寄与するとの仮説の証明に挑む。そして、それらの結果をもとにCISPが植物の低温耐性に寄与するタンパク質であることを証明する。
次に、CISPが植物の低温耐性を誘導するメカニズムに関する知見を得るため、CISPタンパク質の発現・局在様式やCISPタンパク質の修飾、そして免疫沈降法によるCISPタンパク質相互作用因子の探索も実施する計画である。
さらに、今年度の研究結果からCISPのmRNAsやタンパク質が非常に不安定で分解し易いことが明らかになったことから、CISPの機能を理解するためには転写されたmRNAsや翻訳されたCISPタンパク質の安定性と温度との関係性を明らかにする必要があると考えている。よって、今後はCISPのmRNAsおよびタンパク質の温度依存的な安定性や分解様式についても解析を実施する計画である。
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