| 研究課題/領域番号 |
20K05998
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
深山 浩 神戸大学, 農学研究科, 准教授 (60373255)
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| 研究分担者 |
松村 浩由 立命館大学, 生命科学部, 教授 (30324809)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 光合成 / Rubisco / イネ / 酵素特性 / 遺伝子組換え |
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| 研究実績の概要 |
形質転換の際に生じた可能性のある体細胞変異の影響を排除するために，非形質転換イネを花粉親としてCSS系統の戻し交配を2回行った．得られた後代を自殖させて育成したが，稔実率は回復しなかった．これらの結果から，稔実率を低下させる要因が導入したソルガムRbcS遺伝子と連鎖している可能性が考えられた．よって，これまでと異なるソルガムRbcS高発現イネ系統にCSS系統を交配し，新たなCSS系統の作出に着手した．
これまでソルガムRbcSの高発現には，Cabプロモーターを用いてきた．生育不良が用いたプロモーターによる可能性があり，新たにOsRbcS3プロモーターを用いてソルガムRbcSを高発現する系統の作出を行った．
ソルガムRbcSの102番目のLeu (イネではIle) がRubiscoの触媒速度を高める効果を持つことが示唆された．この仮説を検証するために，ソルガムRbcSの102番目のLeuがIle (ソルガムL102I)，イネRbcSの102番目のIleがLeu (イネI102L) となった変異型RbcSを発現する形質転換イネをした．さらに，CSS系統と交配して得たF1を自殖させることで，野生型RbcSを欠損した系統を作出した．
ソルガム以外のC4植物のRbcSについては，ネピアグラス，ギニアグラスについては完全置換系統の作成が完了した．トウモロコシについては高発現系統の作出を行った．
光合成器官で発現しないイネOsRbcS1は，イネRubiscoの触媒速度を増加させ，触媒反応の至適ｐHを酸性化させる効果がある．OsRbcS1の102番目のアミノ酸はIleである．OsRbcS1高発現イネについてイネRbcSをRNAiで発現抑制した系統を作成済みでありRubiscoのX線結晶構造を1.9Åの解像度で決定した．光合成で働くイネRubiscoとOsRbcS1が組込まれたイネRubiscoの構造は非常に類似しているが，我々が着目している102番目のアミノ酸の近傍の106番目のAspがOsRbcS1ではSerとなっており，触媒速度に関係している可能性が示唆された．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CSS系統の戻し交配に関する実験は，生育の回復が見られなかったことから，良い結果が得られたとは言えない．そのため，予定していた戻し交配系統の生理解析は断念することとなった．
その他の実験に関しては，ソルガムL102I，イネI102Lの変異型RbcSの完全置換系統の作成は完了しており，光合成特性や酵素特性の解析を進めている．また，ソルガム以外のC4植物のRbcSについては，ネピアグラスRbcSとギニアグラスRbcSに関しては完全置換系統に作出が完了している．トウモロコシRbcSに関しては高発現系統の作出が完了している．
X線結晶構造解析については，OsRbcS1を含むRubiscoの解析を行い，解像度の精度を上げる予定であるが，おおよその結晶構造の違いが判明した．
以上のことから，本研究はおおむね予定通りに進んでいると言える．
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| 今後の研究の推進方策 |
CSS系統の戻し交配を行ったが生育や稔実率は回復しなかった．それはおそらく，生育に悪影響を及ぼす体細胞変異が導入したソルガムRbcSかイネRbcS（12番染色体に４つタンデムに存在する）と連鎖しているためと考えられる．ソルガムL102I，イネI102Lの変異型RbcSの完全置換系統を作成したが，その際にCSS系統を交配させることでイネ内生RbcSの欠損を変異型RbcS高発現イネに導入した．これらの系統では，稔実率の低下は認められていない．よって，これまで用いてきたCSS系統の生育に悪影響を及ぼす体細胞変異はイネRbcSと連鎖しているのではなく，ソルガムRbcSと連鎖していると考えられる．現在，複数のソルガムRbcS高発現系統にCSS系統を交配して新たな系統の作成を進めている．また，イネOsRbcS3プロモーターを用いたソルガムRbcS高発現イネの作出も行っている．今後，Cabプロモーターを用いた形質転換イネと生育特性や老化に伴うRubisco含量の推移の比較を行う予定である．
今後，予定通り変異型RbcSや様々なC4植物のRbcSの完全置換系統のRubiscoの酵素特性やX線結晶構造解析を進める予定である．さらに，当初予定していなかったが，102番目のアミノ酸以外で酵素特性に関係する可能性がある，βA-βBループやC末端についても変異型のRbcSを作成し，完全置換系統の作出を進めている．これらの系統についても作出が完了したら，生理生化学的解析を行う予定である．
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