| 研究課題/領域番号 |
20K06056
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| 研究機関 | 酪農学園大学 |
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研究代表者 |
薦田 優香 酪農学園大学, 農食環境学群, 准教授 (90716482)
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| 研究分担者 |
中原 健二 北海道大学, 農学研究院, 講師 (90315606)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ダイズ矮化ウイルス / 遺伝子発現 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、北日本のダイズ圃場に慢性的に発生するダイズ矮化病の原因とされる、ダイズ矮化ウイルス（Soybean dwarf virus, SbDV）の増殖機構の解明を目指している。昨年度は、SbDV RNAを機械的にダイズおよびエンドウに接種することに成功し、植物体レベルで、SbDVの逆遺伝学的解析を行う土台ができた。
本年度は、SbDV感染性cDNAクローンを用いて、SbDV遺伝子の発現解析を行った。SbDVのサブゲノムRNAからは少なくとも、ORF3a、ORF3、ORF4、ORF5の4遺伝子が発現すると考えられている。そこで、各遺伝子の3’側にルシフェラーゼ遺伝子を付加したSbDVを構築し、発現量の比較試験を行った。エンドウプロトプラストを用いたトランスフェクションの結果、ORF5はORF3の1/10程度の発現量であることなどが示された。これは、ORF3の終止コドンがリードスルーされる率が、10％程度であることを示唆する結果である。
SbDV ORF5の3’側にGFP遺伝子を付加したSbDV（SbDV-GFP）の構築を行った。エンドウプロトプラストを用いた解析により、SbDV-GFPの感染性の維持とGFPの発現は確認できた。次に、パーティクルガン法によりダイズおよびエンドウの葉や茎にSbDV-GFPを導入し、感染を試みた。SbDV-GFPが導入された細胞でのGFP蛍光は観察できたものの、ウイルスの細胞間移行は確認できなかった。GFPの付加により細胞間移行が阻害されていると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
SbDVの増殖に関わる宿主因子の探索にはモデル植物の方が適すると考え、シロイヌナズナのプロトプラストを用いた実験を試みたが、SbDVの増殖がほとんど見られず、利用が難しいことが判明した。また、これまで使用してきたRNA合成キットが製造中止となり、別メーカーのものを導入したところ、ウイルスRNAの感染性がほどんど得られないという問題が発生した。適したRNA合成キットの探索などに時間を割く必要があるため、やや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）変異の入ったエンドウを用いるなどして、SbDV増殖と植物側因子との関連性を解析する。
２）GFPレポーターの導入位置を変えるなどしたSbDVの構築を行い、細胞間移行などの有無を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
販売停止により入手不可能となった試験管内RNA合成キットに代わるキットを至急探し、感染性評価を行う。また、プロトプラストや植物組織へのウイルス導入に必要な消耗品、ウイルス感染を確認する試薬購入等に使用する。
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