| 研究課題/領域番号 |
20K06057
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
小栗 秀 東京農業大学, 生物産業学部, 教授 (70277250)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | Tomato / Lectin |
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| 研究実績の概要 |
レクチンは糖と特異的に結合して赤血球凝集活性を示すタンパク質の略称である。トマトは、果実にキチン結合性レクチン（TL-Fと略）を含むが、その生体内の役割は未解明であった。我々は、トマト小葉に新規レクチンTL-Lが発現していることを発見し、遺伝子を同定した。TL-Lは小葉と緑色果実に発現し、傷害葉において高発現した。一方、TL-F は果実と根、花弁、葯に発現し、果実においてはサリチル酸応答性を示した。これらの結果は、トマトにおいてレクチンが病害抵抗性タンパク質として機能していることを強く予想させる。本研究では、申請者らが同定したトマトに含まれる構造の異なる二種類のレクチンについて、遺伝子発現の病害応答性の違い、細胞内局在性、病害生物糖鎖との相互作用などの基礎的な知見を集積し、レクチン発現抑制体を用いてレクチンの生物学的機能を解析し、重要な作物であるトマトの耐病性品種の選抜や耐病性品種の分子育種への応用が期待される。
Ｒ２年度は今後の研究に用いる両トマトレクチン遺伝子の過剰発現体の作出と、抗トマトレクチン抗体作製、局在性解析に使用する蛍光発現ベクター作製など基本的なツールを揃えることに注力し、成果を得た。
主な成果：トマト品種間におけるレクチン遺伝子の分布と活性の比較：トマト（Solanum lycopersicum）固定栽培種7系統とSolanum属トマト野生固定種4系統に加えて商業品種1種を温室で栽培し、果実と小葉におけるレクチン活性とゲノム遺伝子における両イソレクチン遺伝子の分布を検出した。品種間の活性の差や、レクチン遺伝子配列を解析した。（2021年度日本農芸化学会において発表）
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
コロナ禍において半年間の研究室閉鎖を余儀なくされたが、この間、トマト栽培を続けた。学生数を制限したため、思うように研究が進展しなかった。しかしながら、初年度の目標であった形質転換体作出は順調に進んでいる。TL-Lの細胞内局在性を観察するために蛍光タンパク質と融合した植物発現ベクターを作製した。当初、TL-L遺伝子の塩基配列の特徴（極端にGCに富んだ繰り返し領域がある）から、大腸菌でのクローニングが難航した。コドンを最適化した人工遺伝子を合成したところ、クローニングを達成することができた。また、一過的な植物発現系を用いて活性型の組み換えTL-Lの生産を確認した。
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| 今後の研究の推進方策 |
①トマトにおける2種のレクチン遺伝子とタンパク質の解析
葉と果実にそれぞれ発現している2種類のレクチン遺伝子TL-LとTL-Fについて、両者の発現制御領域を特定し、組織レベルにおいて発現を比較することで遺伝子発現応答の違いを明確にし、両者の特性を明らかにする。（a） 初年度に調製した抗体を用いて果実および葉組織の蛍光免疫染色により、両者の細胞内局在性を調べる。オルガネラマーカータンパク質との共局在性を検証する。 （ｂ）複数の植物病原糸状菌を葉に接種し、TL-LとTL-F遺伝子の発現をRT-PCRにより検出する（Ｃ）TL-L遺伝子についてゲノムウオーキング法を用いて5’上流配列を取得し、レポーター遺伝子を用いた発現解析用の組み換え体をマイクロトムとシロイヌナズナを用いて作出する。
② レクチン遺伝子ノックダウントマト組換体とトマトレクチン過剰発現シロイヌナズナ組換体を用いた感染抵抗性の検定
レクチン遺伝子の発現は傷害ストレスや病害応答性の植物ホルモンによって誘導されることから、病害抵抗性との関連が強く示唆される。レクチン遺伝子の発現抑制体と過剰発現体を用いた病原菌（細菌・糸状菌）接種実験により、生体内におけるトマトレクチンの役割を実証する。（a） 二種のレクチン遺伝子の発現をRNAiによって抑制したトマト二品種（マネーメーカーとマイクロトム）は作出済みである。これらの遺伝子組換体にFusarium oxysporum f. sp. lycopersici、Botrytis cinerea, Cladosposporium fulvumなどの病原菌を接種し、野生株との病徴の違いを観察する。(b) シロイヌナズナとタバコを用いてTL-LとTL-F 過剰発現体の作出をＲ２年度から継続する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍において研究活動の抑制を余儀なくされた。人工遺伝子の委託注文および、昨年度実施できなかった組換え体の配列解析に使用する。
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