| 研究課題/領域番号 |
20K06228
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
長富 潔 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 教授 (40253702)
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| 研究分担者 |
平坂 勝也 長崎大学, 海洋未来イノベーション機構, 准教授 (70432747)
吉田 朝美 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 准教授 (80589870)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 活性酸素生成系 / 酸化ストレス / プロモーター / 転写制御因子 / 魚病細菌 / flagellin / 培養細胞系 / 免疫応答 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では主にマクロファージ培養細胞系を用いて、E.tarda強毒株及びE.tarda強毒株由来flagellinによるマクロファージの免疫応答、活性酸素生成系の食細胞NADPHオキシダーゼのタンパク質間相互作用、誘導型NO合成酵素 (iNOS) の転写制御機構の解析、並びに細胞内シグナル伝達経路を明らかにすることを目的とした。
本年度は、E.tarda強毒株、もしくは弱毒株の生菌をマウスマクロファージ系株化細胞RAW264.7に暴露し、細胞内増殖能、NO及び細胞内ROSの産性能を検証した。E.tarda強毒株において細胞内生菌数は有意に増加したが、E.tarda弱毒株では細胞内生菌数の増加は全く見られなかった。ギムザ染色による顕微鏡観察でもE.tarda強毒株のみ細胞内増殖が確認されたことから、E.tarda強毒株のRAW264.7細胞における細胞内増殖能が確認された。RT-PCR並びにリアルタイム定量PCR (qPCR) によりE.tarda強毒株、もしくは弱毒株暴露に伴うiNOS mRNAの発現誘導が確認された。更に、Griess法により両菌株暴露に伴うNOの産生が見られたが、弱毒株を暴露した細胞のNO産生量が強毒株に比べて有意に高かった。また、細胞内ROSの産性能についても、弱毒株を暴露した細胞の方が強毒株より細胞内O2-産生量が高い傾向を示し、病原性の異なるE.tarda菌株間で活性酸素生成について明らかな相違が見られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒラメiNOS遺伝子プロモーター領域のクローニングはやや遅れている状況ではあるが、E.tarda強毒株、もしくは弱毒株暴露に伴うマクロファージ系培養細胞の細胞内ROS及びNO産性能の検討並びにE.tarda感染による酸化ストレスに伴うヒラメCu,Zn-SOD遺伝子の転写制御領域の解析ではいくつかの新知見が得られており、現在、これまでの成果を取りまとめて国際学術雑誌への投稿準備中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
食細胞NADPHオキシダーゼ構成タンパク質に対する特異抗体を用いたウェスタンブロット法とフローサイトメトリー法によるタンパク質間相互作用の検証を行う。更に、MAPキナーゼ特異的インヒビター等を用いて活性酸素生成系の細胞内シグナル伝達経路の検証も進めていく。
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