| 研究課題/領域番号 |
20K06377
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
谷口 幸雄 京都大学, 農学研究科, 准教授 (10252496)
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| 研究分担者 |
山田 宜永 新潟大学, 自然科学系, 教授 (40253207)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 希少動物の保全 / 遺伝的多様性 / トキ / ゲノム / DNA多型マーカー / マーカー型タイピング / 次世代シークエンサー / multiplex-PCR |
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| 研究実績の概要 |
希少動物であるトキの保全においては、集団の遺伝的多様性の維持が求められる。このような遺伝的管理の実現には、多数のDNA多型マーカー(一塩基多型:SNPおよび短鎖反復配列多型:STR)を利用した遺伝的多様性評価法の開発が必須である。日本トキ集団は、中国から寄贈された5個体を始祖として形成されてきたが、2018年に新たに2個体が導入された。新規2個体の導入による影響を評価するためには、新規個体のゲノム情報を調査し、それらを考慮した評価法を樹立する必要がある。
昨年度、Reduced representation library(RRL)と次世代シークエンサー(NGS)を組合わせた手法により新規始祖2個体特異的アリルを203個と485個検出しており、今年度はこれらからそれぞれ15個を選抜し、これらの増幅するためのPCRプライマーを設定した。これまで開発を進めてきた日本トキ集団に有効な約200のDNA多型マーカー(SNPおよびSTR)の遺伝子型を判定するmultiplex-PCR/NGS法に上記のプライマーを追加し、multiplex-PCR反応系の再構築を検討した。また、これまでNGSによる配列データの取得は専門業者への委託により実施していたが、昨年度、別のプロジェクトでの共同研究を実施している兵庫県立大地域資源マネジメント研究科内藤研究室にイルミナ社のNGS(iSeq100)が導入されたことから、研究経費の削減も考慮し、こちらを利用するように計画を変更し、NGSサンプル調製の方法について検討を進めた。また、配列データの解析についてもこれまでは専門業者に委託していたが、研究室に遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX Ver.15を導入し、自身でデータ解析する方法の開発を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
NGSによる配列データの取得を、兵庫県立大地域資源マネジメント研究科内藤研究室所有のイルミナ社iSeq100を利用するように計画を変更したが、機器導入の際に初期トラブルがあったことやその後のシークエンスランにおいても十分な量の配列データを得るためのラン条件を設定できておらず、さらに調整の必要が生じている。このため、NGSでの配列データの取得ができない状態が続いており、研究が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
第一に、イルミナ社iSeq100を利用して十分な量の配列データを取得できるようにシークエンスランの条件を調整し、multiplex-PCR/NGS法による配列データが取得できるようにする。その後、新規始祖2個体に特異的なマーカーおよび新規MHCハプロタイプを判別するプライマーを追加したmultiplex-PCR/NGS法により、始祖7個体の配列データを取得し、新たに開発したデータ処理法に従いタイピングデータを得る。これまでに得ているタイピングデータと新たに取得したデータを比較し、multiplex-PCRの条件を再調整し最適化を図るとともに、エラーデータの削除やマーカー型判定基準の設定など、最適な手法について検討し、マーカー型タイピング法を確立する。
最適化されたmultiplex-PCR/NGS法を用いて、飼育下にあり比較的血縁の遠いトキ集団に対しタイピングを実施する。得られた遺伝子型データを始祖集団のものと比較し、遺伝的多様性の経時変化について調査する。さらに、現在のトキ飼育集団の状況を踏まえ、遺伝的多様性維持に向けた交配計画へのタイピングデータの利用法について検討する。
これまでの一連の研究を統合し、多くの希少動物の保全に応用可能な「ゲノム情報に基づく遺伝的多様性の評価・管理システムの構築」の標準的プロトコールとして提示する。
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