| 研究課題/領域番号 |
20K06417
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
吉川 泰永 北里大学, 獣医学部, 講師 (00552043)
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| 研究分担者 |
佐々木 宣哉 北里大学, 獣医学部, 教授 (20302614)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ANXA2 / BRCA2 / DNA損傷修復 / 転写 / 発現制御 / 発現抑制 |
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| 研究実績の概要 |
ANXA2がBRCA2の新規サイレンサー配列に相互作用し、BRCA2の発現にANXA2が関与しているという可能性がある実験結果が得られていた。これまでにBRCA2の転写抑制遺伝子として、二つのタンパク質が報告されており、ANXA2と他の転写抑制因子の相互関係を解析することでANXA2によるBRCA2の転写抑制がどのように行われているのか解明することを第一の目標とした。また、ANXA2はBRCA2の発現量を低下させることで細胞の腫瘍化に関係している可能性がある。そこでANXA2の発現量と腫瘍との関係を解明することを第二の目標とした。
BRCA2の発現にANXA2が関与しているという可能性があるので、ANXA2の発現量の増減が及ぼす影響を調べた。まず、CRISPR/Cas9システムによりANXA2のノックアウトHeLa細胞を作製した。さらにノックアウト細胞にANXA2を補完した細胞も作製した。これらの細胞を用いて、BRCA2が修復に関わる様々なDNA損傷剤に対する感受性を調べた。当初、単純にBRCA2の発現量が増加することで様々なDNA損傷剤に対して抵抗性になると予想していたが、予想に反してノックアウト細胞で感受性になり、補完した細胞では元のHeLa細胞と同程度の感受性になった。そこで、RNA-シークエンスによりノックアウト細胞と補完細胞、元のHeLa細胞の間で発現量が変化している遺伝子を網羅的に解析した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
予想外にANXA2のノックアウトによりBRCA2が修復に関わるDNA損傷剤に対して感受性になった。このことは、ANXA2が転写制御のみで無く、DNA損傷修復やDNA損傷応答の経路に関わっている可能性を示唆するものである。
また、RNA-シークエンスによる網羅的な解析において、ANXA2の発現の有無によりBRCA2の発現量は有意な差が検出されなかった。もしかしたらDNA損傷等の刺激が無いとANXA2はBRCA2の発現に関与しない可能性が考えられた。
以上二つの当初の仮説とは異なる実験結果により、研究の進捗がやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
X線を照射すると細胞におけるANXA2の核への局在が増加する報告があったので、HeLa細胞においても同様の実験を行った。HeLa細胞においてもX線照射すると時間依存的にANXA2の核におけるシグナルが増強する事を免疫染色を行う事で確かめた。DNA損傷の後に転写や修復に関わる可能性があるので、X線を照射した後の解析を行うことにする。すなわち、X線照射後にRNA-シークエンスを行いANXA2のノックアウトによる転写への影響を網羅的に解析する。さらにBRCA2のプロモーターを用いた実験系を組むことで、転写制御のみにフォーカスを当てた解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
1万円弱の次年度使用額が生じたが、次年度に使用する消耗品購入のために使用する予定である。
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