| 研究課題/領域番号 |
20K06445
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
森本 裕子 京都大学, 医学研究科, 特定研究員 (90540097)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 活性酸素 / 精子幹細胞 |
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| 研究実績の概要 |
１) 精子幹細胞のROS産生機構の解明 ： 前年度に同定したNox遺伝子群の発現変化がどのようにmitochondria由来のROS産生と関連するのかを検討した。２）酸素応答で制御される標的遺伝子の機能的同定 a) レンチウイルスによる機能的スクリーニング : 前年度に同定した低酸素・ROS応答で誘導される遺伝子群の機能を調べるために、GS細胞においてレンチウイルスを用いたshRNAによる機能阻害の遺伝子ノックダウン(KD)によるスクリーニングとcDNAの過剰発現を行った。このスクリーニングで増殖、代謝活性（flux analyzer）、幹細胞活性（移植実験）に影響を及ぼす遺伝子について検討した。b) 精子幹細胞の自己複製制御因子に対するNox遺伝子群の影響の解析 : 以前の研究でNox1によるROSの発生が自己複製に必要であることを明らかにしたが、そのメカニズムは未だ不明であった。GS細胞の自己複製にはサイトカインにより誘導される転写因子と非依存性のものがあるので、いずれの転写因子がROSの影響を受けるのか、また、ROS産生や感知にも影響を及ぼすのかを検討した。この実験では野生型GS細胞に加えてNox1KO細胞を用い、低酸素と通常酸素環境下において転写因子の変動を解析した。候補遺伝子の過剰発現及び機能抑制を行い、GS細胞の増殖に及ぼす影響を解析すると共に、遺伝子導入細胞のflow cytometryによりROSレベルを評価した。3) 酸素応答と代謝制御に関わるNox1の解析 2)の項目で得られた遺伝子のうち、Nox1KO GS細胞を野生型GS細胞と比較することで、低酸素応答遺伝子のNox1の標的となる遺伝子を検討した。GS細胞を用いて陽性結果を得られた遺伝子については、CRISPR-Cas9システムを用いることにより、生体内での遺伝子破壊を行い、その機能を検証した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
酸素応答と代謝制御に関わるc-MycおよびHif1遺伝子の解析に関しては令和2年度に実施した研究で明らかにし、既に研究成果を論文にまとめて発表した為。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は精子幹細胞の酸素応答、および代謝制御機構においてNox遺伝子群の他のターゲット遺伝子について解析を進めて行く。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
海外に発注した試薬が新型コロナウィルスの影響で遅れが生じた為。今年度からは、使用することがわかった時点で早めに発註する。
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