| 研究課題/領域番号 |
20K06452
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
|---|
研究代表者 |
鈴木 俊一 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (90391581)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | 形質細胞様樹状細胞 / 不死化 / ゲノム編集 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究は、ウイルス感染防御の最前線に位置し、自然免疫と獲得免疫の橋渡しを担うとされる、ブタ形質細胞様樹状細胞（Plasmacytoid Dendritic Cells: pDC）に着目し、その機能を多角的に評価することのできるin vitro培養系の確立を目的とする。今年度はまず、ブタ骨髄より血球系細胞を分離・培養することにより、pDCの誘導を試みた。2種類の培地（RPMI1640/IMDM）と3種類の添加剤（Flt3L/IL3/TPO）を用いて比較検討した結果、Flt3Lを添加したIMDM培地で培養することにより、低頻度（2－4％）ではあるが、安定してpDCが得られることが確認された。
続いて、この条件で培養した骨髄細胞にレンチウイルスベクターを用いて、テトラサイクリン誘導型の不死化遺伝子セット（EF1α-TetOnAdv、TREtight-SV40LT、TREtight-pigTERT）を導入し、テトラサイクリン存在下で培養を継続することにより、不死化細胞の樹立を試みた。現時点では、pDCの不死化には至っていないが、同時に誘導される古典的樹状細胞(cDC)の不死化には成功した。得られた不死化cDCについては、限界希釈によるクローン化を行い、安定的に増殖する約30個の株化細胞を樹立した。これらについて、FACSによりCD172a/CADM1/CD1の発現解析を行った結果、すべての株でほぼすべての細胞がCD172a+CADM1+である一方、CD1陽性細胞の割合は株によって多様であった。このことから、いくつかのサブセットに由来するブタcDC細胞株の樹立に成功したと考えられる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
骨髄細胞からのpDC誘導の高効率化が困難であったこともあり、不死化pDCの樹立には至らなかった。しかしながら、cDC細胞株を得ることはできており、今後成功する見込みは高いと考えている。cDC細胞株を用いて各種解析を進めることで、pDCを用いた解析を円滑に実施する準備を整えることができるため、生じた若干の遅れを取り戻すことは可能である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
不死化cDCの樹立に成功したことから、現在実施している骨髄由来細胞の不死化誘導手法はおおむね適切であると考えられるため、引き続き現行の方法で不死化pDC樹立を試みる。ただし、pDCの出現頻度が低いため、末梢血等からソーティングにより回収したpDC (CD4+CD172a-low)に不死化遺伝子セットを導入する方法やフィーダー細胞の活用による培養条件改善の可能性等も合わせて検討する。不死化pDCが樹立され次第、Toll-like receptor（TLR）や細胞表面マーカーの発現解析やTLRリガンドに対する応答能の解析等を行い、得られた細胞の性状を明らかにする。また、今年度までに樹立された不死化cDC細胞株についても、同様の性状解析を進める一方、ゲノム編集技術を用いたTLRシグナル伝達系の解析を実施する。これにより、その後に実施予定である、不死化pDCのゲノム編集について速やかに実施な可能な態勢を整えることができる。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
一部物品について、想定より安価で購入ができたため、少額の残金が生じた。
次年度の研究進行に応じて、物品費等に充当する
|
