Importin-α4欠損による精子の構造異常発症機序解明と形態形成の新機構探索

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K06455
• 研究機関: 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所
• 研究代表者: 宮本 洋一 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 細胞核輸送ダイナミクスプロジェクト, サブプロジェクトリーダー (10379084)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 核輸送 / Importin / 精子細胞形成 / 雄性不妊症 / ノックアウトマウス / 遺伝子発現制御

研究実績の概要

核輸送分子Importin-α4は古典的核局在化シグナルの受容体として知られ、輸送担体Importin-β1と複合体を形成して様々な核タンパク質の核への輸送に機能している。我々は以前、Importin-α4遺伝子(Kpna4)ノックアウト(KO)マウスが、精子の顕著な運動性の低下や精子頭部ならびに尾部における構造異常に起因する不妊症を示すことを見出した。免疫組織化学解析の結果、Importin-α4は精母細胞や円形精子細胞の核内に局在することから、核輸送とは異なる核内機能を発揮することが精子の形態形成に重要である可能性が示唆された。そこで昨年度には、KOマウス精巣にて発現変動する分子を同定しその発現制御機構を調べた結果、多くがオープンクロマチンマークの制御下にあることを見出した。これらの結果は、Importin-α4の欠損した精巣ではクロマチンの大規模な構造的・機能的変化が起こっていることを意味している。
今回、KOマウス精子細胞内で起こっている変化をさらに詳しく知る目的で、円形精子細胞を選択的に回収し、クロマチン状態や発現変動遺伝子の解析を新たに実施した。まず、緑色蛍光タンパク質(GFP)と赤色蛍光タンパク質(RFP)を発現するマウス(RBGS:Red Body Green Sperm)の精子をKpna4 KOヘテロマウス卵に顕微授精により導入し、Kpna4KO/RBGSマウスを作出した。次に、RBGSを発現する野生型（WT/RBGS）、ノックアウト（KO/RBGS）マウスの精巣からGFPを指標にセルソーティングを行い高純度の円形精子細胞を回収することに成功した。現在、この回収した円形精子細胞を題材に様々なゲノム解析手法を行い、KO精子細胞内で生じているクロマチンの状態や発現遺伝子の変化を解析しているところである。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Kpna4KO/RBGSマウスを作出し、円形精子細胞を高純度に取得する方法が確立できたことにより、精子の形態形成が始まる段階におけるImportin-α4の機能解明が格段に進んだ。すでにKOマウス由来精子の細胞内で生じているクロマチンの構造的・機能的変化を知るデータが蓄積されてきており、当初の予定のとおり推移していると考える。

今後の研究の推進方策

新たに作成したKpna4KO/RBGSマウス由来の円形精子細胞を対象に、遺伝子発現解析、クロマチン解析をさらに進め、Importin-α4の欠損によってクロマチンにどのような変化が生じ、それが精子の形態形成にどのように影響を与えているかを明らかにしていく。

次年度使用額が生じた理由

新型コロナウイルス蔓延の影響により、予定していた国内外の学会、研究集会への参加をリモートに切り替えたため繰越金が発生した。また、Kpna4KO/RBGSマウス作出に時間を要したことから、ゲノム解析の費用の一部を次年度に使用する計画に変更した。本繰越金分は、一部消耗品費として使用する予定である。

研究成果

• [国際共同研究] Hudson Institute of Medical Research(オーストラリア)
  • 国名: オーストラリア
  • 外国機関名: Hudson Institute of Medical Research
• [雑誌論文] Intestinal microbe-dependent ω3 lipid metabolite αKetoA prevents inflammatory diseases in mice and cynomolgus macaques (2022)
  • 著者名/発表者名: Nagatake Takahiro, Kishino Shigenobu, Urano Emiko, Murakami Haruka, Kitamura Nahoko, Konishi Kana, Ohno Harumi, Tiwari Prabha, Morimoto Sakiko, Node Eri, Adachi Jun, Abe Yuichi, Isoyama Junko, Sawane Kento, Honda Tetsuya, Inoue Asuka, Uwamizu Akihira, Matsuzaka Takashi, Miyamoto Yoichi, et al.
  • 雑誌名: Mucosal Immunology 巻: 15 ページ: 289～300
  • DOI: 10.1038/s41385-021-00477-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Establishment of a stable SARS-CoV-2 replicon system for application in high-throughput screening (2022)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Tomohisa, Saito Akatsuki, Suzuki Tatsuya, Miyamoto Yoichi, Takayama Kazuo, Okamoto Toru, Moriishi Kohji
  • 雑誌名: Antiviral Research 巻: 199 ページ: 105268～105268
  • DOI: 10.1016/j.antiviral.2022.105268
  • 査読あり
• [雑誌論文] Importins: Diverse roles in male fertility (2022)
  • 著者名/発表者名: Nathaniel Benedict, Whiley Penny, Miyamoto Yoichi, Loveland Kate
  • 雑誌名: Seminars in Cell & Developmental Biology 巻: 121 ページ: 82～98
  • DOI: 10.1016/j.semcdb.2021.08.002
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Effects of Importin α1/KPNA1 deletion and adolescent social isolation stress on psychiatric disorder-associated behaviors in mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Sakurai Koki, Itou Taichi, Morita Makiko, Kasahara Emiko, Moriyama Tetsuji, Macpherson Tom, Ozawa Takaaki, Miyamoto Yoichi, Yoneda Yoshihiro, Sekiyama Atsuo, Oka Masahiro, Hikida Takatoshi
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 16 ページ: e0258364
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0258364
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Importin alpha 5（KPNA1）の神経細胞内における新規機能的役割の解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 菅原将樹, 水野克俊, 山口楓香, 加藤諒大, 野宮廣貴, 宮本洋一, 岡正啓, 疋田貴俊, 藤田聡, 山田雅巳
  • 学会等名: 第73回日本細胞生物学会大会
• [学会発表] SARS-CoV-2構成因子ORF6による核輸送制御機構 (2021)
  • 著者名/発表者名: 宮本洋一, 伊東祐美, 鈴木達也, 田中智久, 坂井祐介, 小井土大, 波田千彰, 王彩霞, 大谷真弓, 森石恆司, 立花太郎, 鎌谷洋一郎, 米田悦啓, 岡本徹, 岡正啓
  • 学会等名: 第73回日本細胞生物学会大会
• [学会発表] importin α5は統合失調症の環境因子暴露への影響を変動させる (2021)
  • 著者名/発表者名: 野宮廣貴, 疋田貴俊, 宮本洋一, 岡正啓, 山田雅巳
  • 学会等名: 第94回日本生化学会大会
• [学会発表] インポーティンαの微小核への分子濃縮現象：染色体不安定性とゲノム進化へのインポーティンαの寄与を考える (2021)
  • 著者名/発表者名: 木佐貫玲央, 宮本洋一, 斉藤寿仁
  • 学会等名: 第39回染色体ワークショップ・第20回核ダイナミクス研究会