| 研究実績の概要 |
ヒトiPS細胞に胸腺上皮細胞(Thymic epithelial cell: TEC)分化に必要と考えられる転写因子を、ドキシサイクリン依存的に任意のタイミングで発現させることのできるpiggyBacベクター(Woltjen et al., Nature (2009), Kim et al., Methods Mol. Biol. (2016))を用いて導入した。ベクターが導入されたiPS細胞はピューロマイシンを用い薬剤選択を行なった。piggyBacベクターを用いた遺伝子導入では、導入されたベクターのコピー数はクローンごとで差があることが考えられる。またコピー数の違いは目的遺伝子の発現量の違いに繋がる可能性があるので、複数のクローンを樹立し、いくつかの異なるクローンで以下の分化誘導を進めることとした。
樹立したiPS細胞をマトリゲルコートしたプレート上で、アクチビンAとGSK3betaの阻害剤を用い、TECのオリジナルの胚葉である内胚葉に分化させた。内胚葉への分化は内胚葉の特徴的な遺伝子発現であるSOX17, FOXA2の発現を定量的PCRにて、またCXCR4の発現をフローサイトメトリー にて確認した。株の違いや条件により内胚葉の誘導率に差が生じるため、現在、より効率的かつ安定的な内胚葉誘導法を樹立するために、新たな誘導方法の導入も検討している。
内胚葉誘導後にドキシサイクリンを添加し、導入した転写因子を発現させた。転写因子のmRNAの発現は定量的PCRにて、タンパク質の発現はウェスタンブロッティング法にて確認した。その後、ドキシサイクリン存在下で培養を継続し、胸腺上皮細胞が分化初期から発現する遺伝子(EPCAM、ケラチン5/8(KRT5, KRT8)、 TEC特異的プロテアソーム・サブユニット(PSMB11))が発現することを定量的PCRにて確認した。
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