| 研究課題/領域番号 |
20K06479
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立国際医療研究センター |
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研究代表者 |
岡村 匡史 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 実験動物管理室長 (00333790)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 次世代シークエンサー / バルク法 / ラット / 本態性振戦 |
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| 研究実績の概要 |
振戦は不随意な律動的な体の動きであり、その原因の中で最も頻度が高いのが本態性振戦である。本態性振戦は発症機序や原因遺伝子など未解明な点が多く、有効な根治療法が存在しないため、その治療は対症療法が中心である。申請者らは自家繁殖していたF344ラットにおいて全身性に動的振戦を呈する個体を発見した。本研究は、次世代シークエンサーを用いた改良型バルク法により、短期間で効率的に原因遺伝子を同定することを目的とする。
１）原因遺伝子の同定に向けた全ゲノム解析：後代検定および表現型より、遺伝型をホモ接合型および野生型と確定できた個体4匹それぞれのDNAを抽出し、それぞれの遺伝型4匹分をバルク化して、次世代シークエンサーにより塩基配列を解読し比較解析を行った。2つの解析パイプラインを用い、解析パイプライン1を用いた解析ではホモ接合型および野生型において相違がみられるSNVが1,048,576個検出された。より条件を厳しくした解析パイプライン２を用いて同様の解析を行ったところ、ホモ接合型および野生型において相違がみられるSNVが13,414個検出され、QUAL値が500以上の変異が30個、そのうちホモ接合型変異が9個検出された。今後、これらの変異を有する遺伝子の発現量を定量化し、表現型との関連を検討する。
２）本態性振戦ラットの病態解析：X線CTを用いて4週齢および12週齢個体の骨解析を行ったところ、本態性振戦ラットにおいて、脛骨と腓骨に特徴的な湾曲が認められ、骨形成に関与する遺伝子に変異がある可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請者が開発した本態性振戦ラットのバルク化した全ゲノム配列とリファレンス配列との間で想定以上に多型が多く、原因遺伝子の同定が難航していたものの、ホモ接合型と野生型の比較解析により、原因遺伝子変異を絞り込むことができた。また予定していた行動解析に変わり、X線CTを用いた骨解析を行ったところ、本ラットにおいて特徴的な病態を明らかにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に引き続き、改良型バルク法による解析を進め、本態性振戦ラットの原因遺伝子を同定する。得られた13,413個の変異のうち、QUAL値が500以上の変異が30個あり、そのうちホモ接合型変異が9個（intron variant;3, intergenic region;6 ）検出された。一方で、同腹子にもかかわらず、予想以上にSNPが同定されたため、改良型バルク法が自然発症モデル動物の原因遺伝子同定に、有用であるかを確認するための概念実証実験（POC: Proof of concept）を、原因遺伝子変異が同定されている代表的なモデルマウスを用いて実施する。
病態解析については、脛骨および腓骨の湾曲が観察され、くる病が疑われたため、血液生化学検査によりくる病に特徴的なアルカリホスファターゼ等の上昇がみられるかを確認する。加えて骨の病理切片を作成することにより、詳細な病態解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次世代シークエンサの解析結果が予想とは異なり、より高度な解析が必要となった。その解析が年度をまたぐため、次年度に持ち越したが、その解析はすでに終了し近いうちに納品される予定である。
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