| 研究課題/領域番号 |
20K06492
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| 研究機関 | 高知工科大学 |
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研究代表者 |
中沢 宜彦 高知工科大学, 環境理工学群, 助教(PD) (70514751)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | RNA介在型染色体合着 / 染色体再編成 / 分裂酵母 / 細胞分裂 / コードRNA |
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| 研究実績の概要 |
ゲノムの担い手である染色体が細胞分裂を経て受け継がれる際、相同な染色体間の接着（合着）とその分離のサイクルが繰り返される。これまで、タンパク質に翻訳されない非コードRNAが、相同な染色体間を合着することが示されている。しかし、より普遍的なコードRNAが、相同でない染色体領域間を合着させるかどうかは不明である。このコードRNA介在型合着の理解に挑んだ研究はこれまでに存在しない。本研究は、分裂酵母をモデルとして人為的な染色体再編を誘導することにより、コードRNAを介したDNA配列に依存しない染色体間合着の同定を目指している。
令和2年度では染色体再編を誘導する複数の方法を検討した。その結果、当初計画していたセントロメア破壊による染色体再編法に加え、任意の染色体領域を分裂酵母ゲノム上で転座させる手法、および任意の領域を重複させる手法の２つを新たに開発した。令和3年度は、本補助事業の実験作業を一時中断したため、この期間は上述の新規手法の有効性を検証するデータ解析作業を中心に進めた。その後、これらの手法を適宜用いてRNA介在型染色体合着の探索を再開している。
データ解析の結果、部位特異的組換え酵素Creとその標的配列loxPを用いた方法により、分裂酵母染色体の任意のDNA配列を最長2.6メガベースまで縦列に重複させることが可能であると判明した。この手法は分裂酵母で部分異数性を系統的に誘導する初めての成果とも言える。染色体領域の重複は、重複DNA配列に含まれる遺伝子の発現量増加のみならず、ゲノムワイドな転写量の増減をもたらすことが知られている。セントロメア破壊法では誘発できない新規染色体合着の発生が期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初計画では初年度に染色体結合RNA分子の同定、およびRNA結合DNA配列の特定を進める予定であった。しかし、主たる染色体再編法と考えていたセントロメア破壊法のみでは目的のRNA分子を同定するアプローチとして不十分であることが判明した。これを受けて、初年度は２つの新規再編手法の導入に時間を割いた。さらに、令和3年度は実験作業を一時中断したため、新規再編手法の有効性を検証するデータ解析を中心に進めた。その後、3年度終盤より新規染色体合着同定の試みを開始したが、現状ではコードRNA介在型染色体合着の同定に至っておらず、進捗としてはやや遅れている。4年度は主に染色体領域重複法を用いて、コードRNA介在型染色体合着の検出を目指す。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの成果として、複数の手法で染色体再編を誘発する条件が明らかになった。令和4年度は、有効性が確認された染色体領域重複法を主に用いて、多様なゲノム構造をもつ分裂酵母細胞の中からコードRNA介在型染色体合着を検出する実験を行う。
当初計画では、染色体合着を促す可能性のあるRNA分子を網羅的に同定し、その後遺伝学的な手法によって合着を検証するアプローチを考えていた。しかし、予備的な実験から、分裂酵母細胞における染色体結合RNA分子は微量であり、目的とするコードRNA分子の同定は予想以上に困難であることがわかった。そこで、逆のアプローチとして4年度は遺伝学的手法から新規染色体合着の発生を推測し、その条件においてRNA分子を絞り込む予定である。具体的には、新規染色体合着の発生によって生育回復が見込まれる合着タンパク質コヒーシンの変異体を用いる方法が挙げられる。この変異体の生育が回復する条件の中から新規合着の発生を推測し、その細胞内でコードRNA介在型染色体合着を解析するアプローチを計画している。また、染色体からRNAを除去する機能が示唆されているタンパク質複合体コンデンシンの変異体も利用する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和3年度は実験作業を約6ヶ月間中断したため、この期間は分裂酵母の培養に必要な培地やPCR酵素等の基本試薬等の必要がなかった。また、中断期間以外の期間における実験関連の消耗品は、令和２年度購入分を充当した。
令和4年度は、染色体領域重複法を用いて染色体合着の検出実験を精力的に行う計画である。4年度請求分の助成金は前年度までの助成金と合わせて、分裂酵母用培地やPCR酵素等の基本試薬の購入、オリゴヌクレオチドの合成費、クロマチン免疫沈降用抗体の購入などに使用する。また、RNA分子同定実験を考慮し、マイクロアレイおよびシークエンス実験に関する試薬等の購入も計画している。
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