| 研究課題/領域番号 |
20K06493
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
萬年 太郎 立命館大学, 生命科学部, 助教 (50535763)
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| 研究分担者 |
八谷 如美 地方独立行政法人東京都立産業技術研究センター, 開発本部開発第二部バイオ応用技術グループ, 主任研究員 (30408075)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 核内RNA顆粒 / RNA結合タンパク質 / プロテオミクス / ダイセクション / 相分離 |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではガン細胞で形成される核内RNA顆粒の新規構成因子やRNAを同定し、構造体形成における役割を明らかにすることで、ガン細胞における核内RNA顆粒の生理機構の解明をおこなっている。本研究の結果は核内RNA顆粒の新規構成因子や形成機構などの基礎的解析にとどまらず、ガン細胞特有のncRNAにより遺伝子発現が後天的に制御されているという新たな視点でのガン病態解明につながることが期待できる。
今年度は細胞核内の核内RNA顆粒の精製・濃縮を①構造体の性質を利用した精製、および②レーザーマイクロダイセクションを用いた精製によりおこなった。
構造体の性質を利用した精製では、細胞内で形成されている構造体をショ糖密度勾配遠心法などによる精製をおこなったが、構造体の精製には至らなかった。これまでの解析から、構造体はRNAを骨格とした相分離によるタンパク質間の弱い相互作用により形成されていることが示唆されている。このことから、近年開発された細胞内の目的タンパク質と近接するタンパク質をビオチン化標識する手法である近接依存性標識法を精製過程に加えることにより構造体の精製・濃縮の改善を試みている。
レーザーマイクロダイセクションを用いた構造体の精製では、ダイセクターによる核内RNA顆粒の切り出しと切り出した構造体の回収をおこない、質量分析装置によるタンパク質の同定をおこなった。現在、同定したタンパク質について解析をおこなっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①構造体の性質を利用した精製においては、精製過程を改良することが判明し、近接依存性標識法を加えることにした。現在、近接依存性標識法による解析は進んでいる。
②レーザーマイクロダイセクションを用いた精製においても、構造体の切り出しやタンパク質の同定ができている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、近接依存性標識法による解析により核内RNA顆粒の構成因子の同定やレーザーマイクロダイセクションによる核内RNA顆粒の構成タンパク質や骨格RNAの同定を進めていくことにより、ガン細胞における核内RNA顆粒の生理機構の解明をおこなっていく。
構成タンパク質の同定については、候補タンパク質の免疫染色をおこない細胞内局在を解析する。その後、siRNAによるノックダウンやタンパク質の機能ドメインについて解析することで、これらのタンパク質が構造体の形成機構にどのように関与していくか明らかにしていく。
また、骨格RNAの同定については、構成タンパク質のPAR-CLIP解析やダイセクションで単離した構造体のRNAからの次世代シークエンス解析により候補RNAを探索する。その後、それらの候補RNAのRNA-FISHをおこなうことで構造体の骨格RNAを同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験の進捗により次年度使用額が生じた。
翌年度分と合わせて、同定したタンパク質の解析などに使用する予定である。
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