| 研究課題/領域番号 |
20K06505
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
名倉 淑子 (中田) 京都大学, 高等研究院, 特定助教 (70799220)
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| 研究分担者 |
藤川 鷹王 京都大学, 高等研究院, 特定研究員 (70839688)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 膜タンパク質 / 化学ケージ / 分子自己集合 / 構造解析 / X線結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
「化学ケージ結晶化法」の方法論確立を目的とし、本研究では、結晶化が非常に困難とされている膜タンパク質を化学ケージに内包させX線結晶構造解析に応用し、革新的な本法の有用性と汎用性を実証する。実用化のためには克服しなくてはいけない課題があり、2020年度はそれらを克服するための方策を模索し、有効な技術の開発と構築を進めた。
研究１：膜タンパク質の機能を保持したままケージに内包する
通常、化学ケージは有機溶媒中において合成され、その環境下において安定であるが、精製した膜タンパク質は水溶液中に存在する。そのため、膜タンパク質が構造や機能を保持できる水溶液中においても安定に自己集合できるよう、化学ケージの改変を行なった。化学ケージをより安定化するために共有結合によるケージを設計し、その調整法にも目処が立った。今後、繊細な膜タンパク質を内包するためには、更にいくつかの条件をクリアしなくてはならない。より水溶性を高めること、十分なサイズを確保することが次の課題である。
研究２：ケージ内での膜タンパク質を均一にする
X線結晶構造解析を行うには、化学ケージ内に目的のタンパク質を均一な位置に固定しなければならない。タンパク質を固定化するためのリンカーの設計と固定化タグの模索を行なった。リンカーは、自由度の高低や形状の異なるものについてそれぞれ長さを変えて数種類ずつ準備した。また、タンパク質を安定に化学ケージに固定化するためのタグが必要不可欠であり、2020年度は特にこの固定化タグの開発に注力した。ファージディスプレイを用いて、化学ケージに特異的に強固に固定するためのタグを探索し、これまでいくつかのタグ配列を得ることに成功した。今後、これらの結合評価を進め化学ケージ固定化に応用していく。タグの有効性が確認できたら、そのタグ配列をリンカーと共にタンパク質に挿入し、いよいよ化学ケージへの内包実験を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究１：膜タンパク質の機能を保持したままケージに内包する
化学ケージが水溶液中でも安定に自己集合出来るようにするため、これまでのパラジウム金属配位を用いたケージではなく、共有結合を用いたケージの設計を行った。その調整法を検討したところ、おおよそ調整の目処がたった。このケージをもとに内外に化学修飾を施す計画である。さらに、２０２０年度は、膜タンパク質を固定するために化学ケージの内側に数種類の固定点を設計し、この固定点の化合物をもとに、ファージディスプレイスクリーニング用と結合評価用にそれぞれ固定点の化合物を合成した。この固定点化合物が結合タグと強固に特異的に結合できるか、現在、結合評価を進めている。
研究２：ケージ内での膜タンパク質を均一にする
膜タンパク質をケージ内に均一に固定するために必要な、リンカーと結合タグを設計した。リンカーと結合タグの配列をタンパク質の末端に挿入し、最適な距離をもって化学ケージに固定化する。形状の異なる３種のリンカーを設計し、それぞれ長さのバリエーションを持たせてDNAを作製した。また、ファージディスプレイを用いて、化学ケージにタンパク質を固定化するためのタグ配列の探索を行った。ファージ表面にランダムな配列を持ったペプチドを提示させ、化学ケージ固定点と結合するものを選択し、そのペプチド配列を解析した。これまで、いくつかの特定配列を得ることに成功している。現在、この配列と固定点化合物との結合評価を進めているところであり、十分な結合力と特異性があるものを選出する。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究１：膜タンパク質の機能を保持したままケージに内包する
共有結合を用いた化学ケージ合成を進める。まだ、水溶性やサイズに課題があるため、それらを改善するための化学修飾を施す。水溶液中において安定で膜タンパク質内包に十分なサイズの化学ケージの合成に成功したら、いよいよ、タンパク質内包実験を行う。さらに、化学ケージ自体の配向性を制御するために更なる化学修飾を設計し、結晶化への方策を検討する。
研究２：ケージ内での膜タンパク質を均一にする
ファージディスプレイによって得られたペプチド配列が、化学ケージ固定点に十分な強さで特異的に結合できるかを評価する。要件を満たした固定化タグ配列を膜タンパク質末端に挿入した変異体発現株を作製、発現精製を行う。リンカーの形状や長さ、固定化タグの種類など可能な限り多様なものを準備し、化学ケージへの内包実験に備える。
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