| 研究実績の概要 |
一般に、ヒドロゲナーゼは酸素存在下では不活性化されるが、一部の[NiFe]ヒドロゲナーゼは酸素耐性を持ち酸素存在下でも活性を維持できる。酸素耐性獲得のためには特異な鉄硫黄クラスターを持ち、酸化に伴い鉄硫黄クラスターが構造変化し電子を供給することが重要であることが分かっているが、酸素耐性の無い標準型の[NiFe]ヒドロゲナーゼでも、酸化に伴い鉄硫黄クラスターの構造変化が起こっているようなデータが集まりつつある。本課題では、硫酸還元菌由来の標準型[NiFe]ヒドロゲナーゼの酸化還元に伴う鉄硫黄クラスターの構造変化を調べることで、[NiFe]ヒドロゲナーゼの酸素耐性獲得の要因を検討する。
硫酸還元菌の大量培養を行い、次いでグローブボックス(N2:97%, H2:3%)内で嫌気的に酵素の精製および結晶化を行った。また、得られた結晶を大気に暴露し酸素による酸化型結晶を調製した。これらの２状態についてX線回折実験を行ったが、いずれも目標としていた分解能(1.0-1.5 Å)には届かなかった。そのため、結晶化条件の見直しを行った。沈殿剤である2-methyl-2,4-pentanediol(MPD)は、添加時に反応熱(水和熱)を生じることによって、結晶化母液中の酵素分子にダメージを与えることが考えられたため、MPDの添加速度を遅くすることを試みた。具体的には、0 ℃に設定したドライブロックに、酵素溶液をエッペンチューブに入れたものをセットし、MPDを少量ずつ加えてはガラス棒で撹拌する操作を行った。嫌気条件において従来よりもサイズの大きい結晶を高い頻度で得られるようになった。
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