| 研究実績の概要 |
本年度は、FANCM-MHF複合体のDNA認識機構の構造的基盤を明らかにすることを目的として生化学、構造解析を行った。まず、ニワトリFANCMヘリカーゼドメインを含むコンストラクトを作成した。現在FANCMヘリカーゼドメイン単独およびFANCMヘリカーゼ-MHF複合体のコンストラクトより組換タンパク質を発現精製している。精製タンパク質が得られ次第、生化学、構造解析を行う予定である。
一方、昨年度結晶構造を報告したFANCM-MHF複合体とCENP-SX複合体に関しては両者のDNA結合解析を詳細に行った。その結果、同じDNAに対して結合のモードが異なることが明らかになった。特にFANCM-MHFは主に単一の複合体で結合するのに対して、CENP-SXは複数で結合していると思われる結果が得られた。さらにDNAとの相互作用を原子レベルで明らかにすることを目的として、DNAとの結晶化を行った。その結果、二重鎖DNAと混合した条件で結晶を得ることに成功し、MHF（CENP-SX）複合体とDNAとの結晶化においても同様な結晶が得られた。SDS-PAGEおよびDNA標識蛍光剤によって結晶を解析した結果、どちらもCENP-SX-DNA複合体であることが判明した。これは、昨年度に報告したとおり、結晶化溶液中の有機溶媒や酸化条件によってFANCMが複合体より解離したものと思われる。結晶にX線を照射したところ、低分解能の回折が得られた。DNAの長さや末端形状、結晶化条件やクライオ条件を改善した結果、分解能が向上した。
これらの結果は論文として報告した。(Ito and Nishino, 2022)
現在は構造決定を目的として、分子置換法や重金属置換体による位相決定を行っている。
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