| 研究課題/領域番号 |
20K06519
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
丹羽 達也 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (50588530)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | フォールディング / 質量分析装置 / 無細胞タンパク質合成系 |
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| 研究実績の概要 |
前年度に引き続き、未だ予測することが難しいタンパク質フォールディングについての理解を深めるために、ペプチドタグとナノLC-タンデム質量分析装置を利用した試験管内でタンパク質フォールディングを進化させる実験系の構築を目指している。
前年度に見出したペプチドタグを元にして、１ないし２アミノ酸の点変異を加えることによりその種類を大きく増やすことに成功した。ごく一部、うまく測定できないタグが見受けられたが、大部分についてはモデル系で問題なく定量評価が可能であることを確認することができた。現状では100種類以上のタグが１度の測定に利用できるというところまで準備が進んでいる。また測定の条件設定についても、別々に翻訳反応を行うよりも１つの試験管の中で異なるmRNAを混ぜたものをヘテロに合成させたほうが測定結果のばらつきが少ないということもわかったので、この知見を今後の実験条件の設定に役立てたい。
特定のタンパク質を対象としたスクリーニングの系の構築については、遺伝子ライブラリの作成の遅れや、ペプチドタグの種類の検討のためにまだ実現できていない。前者はおおむね目処がついたが、後者については、当初の予想よりも質量分析装置での測定を数多くこなさなければならなさそうだということが見通されてきたため、逆相LCでの保持時間が大きく異なるペプチドタグについても新たに検討を行い、測定の効率化を目指している。保持時間が大きく異なるペプチドタグについては既に一部が実用できそうなところまで来ているが、さらに種類を増やして測定の効率を上げていきたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前年度において、新型コロナウイルス感染症への対策のために生じた遅れを取り戻し切れていない状況にある。また概要で記した通り、当初の予想よりも質量分析装置での測定の数をより多く処理しなければならなさそうであるという見通しとなったため、LCでの保持時間をずらして一度に測定できるペプチドタグの数を増やすという工夫をする必要が生じた。そのためペプチドタグについての開発により多くの時間を割くことになってしまったのも要因の１つである。
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| 今後の研究の推進方策 |
ペプチドタグの準備の目処が立ち次第、できるだけ早くモデルタンパク質のフォールディングの改善に取り掛かる。当初の予定ではUlaFタンパク質を用いる予定だったが、それだけでなくMetFなどについても並行して行うことを検討する。それに加えて、サンプル調製および測定についての数が膨大となることが予想されるため、それを効率よくこなすための枠組みを作る必要がある。概要で述べたように一度に多種類のメッセンジャーRNAを１つの試験管の中でヘテロに発現をさせたほうが結果が安定するという予備実験結果が得られているため、この結果を元に、具体的な反応スケールや数などを適切に設定し、実験手順のプラットフォーム化を急ぎたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度末に取得予定であった消耗品の一部について、調達に滞りが生じたため、それらを次年度分の決済として繰り越す必要が生じてしまった。しかし額としてそれほど大きなわけではなく、全体としての予算消化はほぼ当初の計画通りに進めることができているので、引き続き適切な使用を心がけていく。
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