| 研究課題/領域番号 |
20K06531
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
児島 将康 久留米大学, 付置研究所, 教授 (20202062)
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| 研究分担者 |
椎村 祐樹 久留米大学, 付置研究所, 助教 (40551297)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | グレリン / グレリン受容体 / 立体構造 / クライオ電子顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
グレリンは申請者らが発見した摂食亢進作用を示すペプチドホルモンで、N末端から３番目のセリン残基が脂肪酸のオクタン酸によって修飾されている。しかもこの脂肪酸修飾がグレリンの活性に必要であるという特徴を持つ。なぜグレリンは脂肪酸の修飾がないと活性を示さないのか、それを明らかにするためにはグレリンが結合したグレリン受容体の立体構造の解明が必要である。そこで本研究では高活性型の変異グレリン受容体のX線結晶構造解析や、クライオ電子顕微鏡によるGタンパク質との複合体を解析することによって、グレリンが結合した活性型グレリン受容体の立体構造を明らかにすることを計画した。
昨年度にはアンタゴニストが結合した不活性型のグレリン受容体の立体構造を解明したので、今年度からはグレリンのペプチドそのものが結合した活性型グレリン受容体の立体構造解明に取り組んだ。活性型構造の解明では、クライオ電顕を使った解析を行うことにした。
Tethering strategyを使って、グレリン受容体（GHSR）とminiGqの融合タンパクを作成し、Gβγを共発現して精製を行った。リガンドとしてはグレリンそのものを使った。予備的な検討では、200 kV電顕で撮影後、310,000粒子 (615画像) からスタートして、4.4Å分解能までできた。
今回は200 kV電顕によるデータ取得であるが、共タンパク質であるscFv16やNb35を用いることができれば、もう少し分解能が上がる可能性がある。さらに300 kVのクライオ電顕を使用可能であるならば、さらに高い分解能で立体構造の決定が可能であると考える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
クライオ電顕で観察できるグレリン受容体サンプルを得ることができた。予備的な観察ではグレリンが結合したグレリン受容体の立体構造がほぼ観察できた。しかしまだ解像度が十分でない。これらのことから、進捗状況は「おおむね順調に進展している」とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回、200 kVクライオ電顕によるデータ取得によって解像度が4.4Å分解能まで達成できた。グレリンの配位なども観察できているが、この解像度では活性型/不活性型の立体構造解明にはまだ十分ではない。そこで今後はさらに解像度を上げる必要がある。そのために、共タンパク質であるscFv16やNb35を用いることができれば、もう少し分解能が上がる可能性がある。さらに300 kVのクライオ電顕を使用可能であるならば、さらに高い分解能で立体構造の決定が可能であると考える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品の入荷遅れなどのために、当初の計画より物品費の使用が少なくなったため。本年度は物品費を使用するとともに、学会参加などの旅費も使用予定である。
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