| 研究課題/領域番号 |
20K06534
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
大保 貴嗣 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (90207267)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | カルシウムポンプ / ヘリックス / グリシン / 脱共役 / 柔軟性 / 構造変化伝達 / 復帰突然変異 |
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| 研究実績の概要 |
Ca2+ポンプの輸送サイクルでは、細胞質領域のA（アクチュエーター）ドメインが大きく回転してP（リン酸化）ドメインと結合し、この構造変化が膜ドメインの輸送部位に伝わる。これに伴ってE1PCa2の輸送部位に閉塞されていたCa2+が内腔へ放出される。ヘリックスM2はAドメインに繋がっている。M2膜結合部分（M2m）と細胞質部分（M2c）連結領域にあるGly105のAla 置換により連結部の柔軟性を障害すると、EP異性化、およびエネルギー共役（Ca2+輸送/ATP加水分解）が阻害された。この阻害は112位置への追加Gly置換（G105A/A112Gにより救済された（復帰突然変異）。今回、エネルギー共役におけるM2mの役割を調べる目的で、M2mに追加Gly置換を行った。G105A/V93GのみG105Aの脱共役とEP-decay阻害から救済された。野生型ではAドメインが大きく動くとき、G105の柔軟性が機能してM2連結部でM2が折れ曲がり、M2mに構造変化が伝達されCa放出が起こると推測した。ダブル置換体G105A/V93Gは、M2連結部の構造変化をバイパスして、Ca2+-gate開口のための有効な構造変化をM2下部に伝達できると予想される。この結果より、細胞質Aドメインの大きな動きにより駆動されるV93周辺の構造変化が、Ca2+-gate開口、およびCa2+放出に重要なswitchであると考えられる。これに関連して筆者はM2への変異体検索により、新しくCa2E2Pを蓄積できる変異体を発見した。現在この変異体の速度論的解析を行っている。この構造解析を加えればCa2E2Pから内腔へのCa放出に関して新しい切り口から共役機構を提唱できると考えられる。また、またフリッパーゼ発現系を立ち上げ、並行して変異体の構築、解析に着手している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Caポンプのエネルギー共役におけるM2mの役割を調べる目的で、M2mにGly置換を行うことにより、V93がCa2+-gate開口、およびCa2+放出に重要なswitchであることを見出した。これにより、細胞質領域のAドメインの動きに伴ってM2mに構造変化が伝達されCa放出が起こることを明らかにした。ダブル置換体G105A/V93Gは、M2連結部の構造変化をバイパスして、Ca2+-gate開口のための有効な構造変化をM2下部に伝達できることを見出した。これに関連して筆者はM2への変異体検索により、新しくCa2E2Pを蓄積できる変異体を発見した。この解析から、Ca2E2Pから内腔へのCa放出に関して新しい切り口から共役機構を提唱できる研究の方向性を切り拓いた。また、またフリッパーゼ発現系を立ち上げ、並行して変異体の構築、解析に着手しできている。以上より、おおむね順調に進展していると判断した。
Ca2+ポンプのリン酸化中間体アナログ(Ca2E1BeF、Ca2E2BeF)の原子構造解明のため、安定化、精製条件の確立、クライオ電顕による構造解析用試料の検討、作成を、共同研究で進める予定であった。しかし、COVID-19のため出張しての共同研究などができなくなった。これについては日本のCOVID-19パンデミック状況をみて継続する。
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| 今後の研究の推進方策 |
CaポンプのM2mに追加Gly置換を行うことにより、V93がCa2+-gate開口、およびCa2+放出、すなはちエネルギー共役におけるに重要なswitchであることを見出した。これにより、細胞質領域のAドメインの動きに伴ってM2mに構造変化が伝達されCa放出が起こることを明らかにした。今年度、Ca2+-gate開口のための有効な構造変化をM2下部に伝達できる道筋をより詳細に解析する。これに関連して筆者はM2への変異体検索により、新しくCa2E2Pを蓄積できる変異体を発見した。この構造解析から、Ca2E2Pから内腔へのCa放出に関して、Caポンプ共役機構を探るための変異体をさらに構築、解析することにより詳細に解析し、作業仮設を検証する。また、フリッパーゼ発現系を用いて、フリッパーゼ変異体の構築、発現、解析を進める。Ca2+ポンプのリン酸化中間体アナログ(Ca2E1BeF、Ca2E2BeF)の原子構造解明のため、安定化、精製条件の確立、クライオ電顕による構造解析用試料の検討と作成を共同研究で進める予定であり、日本のCOVID-19パンデミック状況をみて継続する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Ca2+ポンプのリン酸化中間体アナログ(Ca2E1BeF、Ca2E2BeF)の原子構造解明のため、安定化、精製条件の確立、クライオ電顕による構造解析用試料の検討、作成を、出張して共同研究で進める予定であった。しかし、COVID-19のため出張しての共同研究などができなくなったため、そのための研究費と旅費が使えなかった。令和2年度に予定していた残りの研究、出張を令和3年度に行い、次年度使用額B-Aを使用する予定である。また、当初令和3年度に予定していた研究に関しては、予定通り行う計画であり、助成金は計画通りの使用を予定している。
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