| 研究課題/領域番号 |
20K06535
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
水野 広一 群馬大学, 生体調節研究所, 助教 (30321821)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 開口放出 / インスリン / 分泌顆粒 / 生細胞観察 |
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| 研究実績の概要 |
これまでに、インスリン顆粒の輸送制御について研究を進め、低分子量GTPase Rab27がそのエフェクタータンパク質グラニュフィリンやシンタキシン/Munc18複合体と共にインスリン顆粒を細胞膜にドッキングさせることを明らかにしてきた。本年度は、シンタキシンの立体構造変化を引き起こすMunc13に着目し、研究を進めた。開口放出は、直前の顆粒の挙動から複数の様式に分類されるため、全反射顕微鏡下にインスリン顆粒の開口放出の直接観察を行ったところ、Munc13bノックダウンにより細胞膜にドッキングしたインスリン顆粒の開口放出が選択的に阻害され、深部から細胞膜近傍に飛び込んでくる顆粒の開口放出には影響しなかった。一方、Munc13aノックダウンには、このような効果はみられず、これらの結果は、Munc13アイソフォーム中で主にMunc13bがドッキング顆粒の開口放出に関与する可能性を示唆している。また、生きた膵β細胞内でインスリン顆粒の開口放出に伴うMunc13動態の観察を行うことを目的に、CRISPR/Cas9システムを利用したマウスβ細胞株MIN6細胞のゲノム編集を行い、Munc13aおよびMunc13bノックアウト細胞株を作成した。このMunc13ノックアウト細胞株に内因性レベルの蛍光標識Munc13を入戻すことで、生理的なMunc13の動態観察が可能となる。さらに、Munc13bのインスリン顆粒局在機構を明らかにするため、Munc13-GFP発現MIN6細胞からGFPに対するNanobodyを用いた免疫沈降法と質量分析法の組み合わせによりMunc13結合タンパク質の同定を試み、約120kDaと140kDaの候補タンパク質を見出した。両者は、それぞれ神経小胞と分泌顆粒に局在することが報告されており、これらのタンパク質がMunc13bのインスリン顆粒局在に関わる可能性がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
膵β細胞に発現する主なMunc13アイソフォームは、Munc13aとMunc13bである。本年度までに、マウスβ細胞株MIN6細胞にsiRNAを導入することで両アイソフォームの発現抑制を行い、Munc13bがグルコース刺激により惹起されるドッキング顆粒からの開口放出に関与することを明らかにした。また、ゲノム編集により、Munc13aおよびMunc13bノックアウトMIN6細胞株を作成した。Munc13bノックアウト細胞株は、Munc13bノックダウンと同様にグルコース応答性インスリン分泌が障害されており、その結果として細胞内にインスリンが著しく貯留していた。Munc13bノックアウト細胞に内因性レベルの蛍光標識Munc13bを入戻した細胞を用い、開口放出に伴うMunc13bの動態観察やMunc13b局在の有無によるインスリン顆粒の開口確率の違いについて解析を進めている。これらの解析に加え、Munc13bのグラニュフィリンを含むドッキング複合体への影響を検討するため、Munc13b入戻し細胞に対して超解像顕微鏡を用いたグラニュフィリンのナノ構造解析を計画しており、Munc13ノックアウト細胞は、本研究に欠かせない実験材料である。さらに、未だ解析途中であるが、Munc13結合タンパク質候補を免疫沈降法により同定した。これらの状況から、概ね計画は順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．ドッキングしたインスリン顆粒開口放出過程におけるMunc13bの機能解析：Munc13bノックアウト細胞株に内因性レベルの蛍光標識Munc13bを入戻した細胞を用い、グルコース刺激によるインスリン顆粒開口放出を観察することで、Munc13bの有無による開口放出確率の違いを明らかにする。同時に、インスリン顆粒に局在するMunc13bの開口放出に伴う動態につても明らかにする。また、同様の実験をMunc13a入戻し細胞を用いて行い、両アイソフォームの機能差を比較検討する。
２．Munc13bのドッキング装置に与える効果検討：超解像顕微鏡を使い、Munc13bを入戻した細胞でドッキング複合体を構成するグラニュフィリンのナノ構造解析を行い、Munc13bの有無によるドッキング顆粒上のグラニュフィリンクラスタの大きさを比較検討する。同様の解析を、他のドッキング複合体構成因子のMunc18-1について行い、両者の結果を比較検討する。
３．Munc13bのインスリン顆粒開口放出に関与する領域同定：Munc13は、C2ドメイン、C1ドメイン、およびMunc13タンパク質に固有のMHDドメインを持つマルチドメインタンパク質である。膵β細胞に発現するMunc13aとユビキタス型Munc13bのドメイン配列は全く同じであり、両タンパク質のサイズも近い。しかし、現在までのデータは、インスリン分泌を制御するのは主にMunc13bである可能性が示唆されている。そこで、キメラMunc13の発現系を作成し、Munc13bノックアウト細胞株に発現させ、グルコース応答性インスリン分泌の回復を指標にインスリン分泌に関与するMunc13b領域同定する。また、キメラMunc13の発現系は、Munc13結合タンパク質の解析にも用いる。
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