| 研究課題/領域番号 |
20K06544
|
|---|
| 研究機関 | 大阪大学 |
|---|
研究代表者 |
西 毅 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (60403002)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
|
| キーワード | スフィンゴシン１リン酸 / 輸送体 / S1P / リゾリン脂質 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究ではスフィンゴシン１リン酸（S1P）を血管内皮細胞において排出する輸送体、SPNS2と赤血球および血小板の輸送体、MFSD2Bがそれぞれどのように基質であるS1Pを認識し、輸送した後に受容体を活性化しているのかそのシグナル伝達の分子機構における普遍性と特異性を明らかにすることを目的としている。
これまでS1P輸送体を含むリゾリン脂質輸送体で基質がどのように輸送されているかその分子機構を明らかにすることを目指して解析を進めている。S1P輸送体であるSPNS2とMFSD2Bでは部位特異的変異体を作成することで、輸送活性に必須な残基や領域を明らかにし、基質が輸送体内でどのように運ばれるのかのモデルを構築した。さらにS1P輸送体であるMFSD2Bの相同体であり、リゾポスファチジルコリン（LPC）輸送体として機能するMFSD2Aとでその輸送の基質特異性に関わる残基の解析を進め、それぞれに関わる領域を明らかにすることができた。本年度はさらに輸送体によって排出されたS1PによるS1P受容体を活性化する経路についても解析を進めた。培養細胞に蛍光タンパク質を融合させたS1P受容体を発現させることで、培養液中のS1P濃度の変化によって受容体の活性化を評価する系を構築し、輸送体によって細胞外に排出されたS1Pが細胞膜上でキャリアタンパク質によって運ばれてS1P受容体を活性化することを可視化することができるようになった。
輸送体の高次構造を明らかにするためのタンパク質の大量発現系と精製法の検討も引き続き進めたが、大きな改善が得られず結晶化には至っていない。培養細胞を用いた発現系でも昨年度に改善した結果からの進展が得られていない。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
輸送体によるS1PやLPCなどの輸送機構に関する解析はその必須残基や領域の同定などの結果を得ることができた。もう一方の柱である構造解析に関する部分で大量発現と精製が進んだものに関しては結晶化を進めているが、結晶を得るには至っていない。
|
| 今後の研究の推進方策 |
これまでと同様にSPNS2、MFSD2BおよびMFSD2Aを用いて基質認識、輸送機構の解析を変異導入などの遺伝子操作の技術を用いて進め、これに構造の情報などを組み合わせることで、SPNS2とMFSD2Bの間のS1P輸送機構の普遍性について解明する。輸送体によって放出されたS1Pによる受容体の活性化機構についても引き続き解析を進める。やはり高次構造を明らかにすることが輸送機構の解明に大きく寄与することは明白である。その決定を目指して、SPNS2およびMFSD2Bの全長タンパク質の大量発現系の構築と最適化を進める。また、タンパク質の可溶化、精製、結晶化条件の最適化を進め高次構造の決定を目指す。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度中に大きく進展した結果に対して解析が年度内に行うことが間に合わなかったため論文の作成などを含め、使用予定の経費が執行できなかった。それらを引き続き解析を進めるとともに論文化などを翌年度に行う。
|
