| 研究課題/領域番号 |
20K06556
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
森 博幸 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 准教授 (10243271)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | VemP / 分泌タンパク質 / 翻訳停止 / SecDF2 / SecY / レポーター系 / prlA |
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| 研究実績の概要 |
VemPは、ビブリオ属細菌が持つ分泌モニター因子であり、細菌のタンパク質膜透過能の程度に応答して、自身の翻訳停止時間を調節し、mRNAの二次構造を変化させることで同一オペロン下流に存在するSecDF2の発現を制御する。VemPの翻訳停止解除は、膜透過装置上で起こる事を既に見出しているが、その分子機構の詳細は不明であった。
昨年度は、VemP翻訳途上鎖と相互作用する因子を網羅的に探索し、既存のSec因子に加え、SRP, PpiDの関与を明らかにした。このうち、PpiD（ペリプラズムに活性中心を持つ膜結合型シャペロン）は、SecDFと共同的に働くことで、翻訳停止の解除を引き起こす事を見出した。さらには、VemPの翻訳停止解除のタイミングを制御するcisエレメントArg-85の同定に成功した。
本年度は、他のcisエレメントの同定を進めるために、変異体の簡便なスクリーニングを可能とするvemP-blaレポーター系を構築した。ppiD欠失株では、VemPの翻訳停止は安定化され下流に連結したbla領域の翻訳は起こらず、Ampを含む培地中で生育できない。目的のcis変異を持つvemP-bla変異体では、、ppiD欠失株中でもアレストが不安定化し、bla領域の翻訳が進んでAmp耐性を示す。このレポーター系を用いて、Arg-85のN末端側に位置する短い疎水性領域に着目し、変異解析を進めた。その結果、この領域の疎水性度とAmpを含む培地中での生育の間に有意な相関があることを明らかにした。
更に、本レポーター系を用いて翻訳停止の解除に関わるtrans因子の探索も進め、膜透過装置の中心因子SecYの変異であるprA4の導入により、VemPの翻訳停止が大きく低下することを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目標は、VemPの翻訳停止に関わる新規因子の同定とその作用機序の解明である。幸いな事に翻訳停止に必須の役割を持つPpiDの同定に昨年成功した。また、分子機構解明の手がかりとなる、翻訳停止に関わるcis因子の同定に関しては、新たなレポーター系を構築しppiD欠失株を組み合わせた解析から、簡便に多数の変異体をスクリーニングできることを示した。この方法を用いて、既存のArg-85残基に加えて、VemPの翻訳制御の解除に重要な役割を持つ短い疎水性領域の同定にも成功した。同様の手法により、他の候補領域の特定も進めており、今後も順調な進展が期待できる。
更に、prlA4変異の導入によりSecYの関与が明らかとなった事から、VemPの翻訳停止の解除に関わる新たなsecY変異の同定も可能であると考えられる。現在、新たな変異体スクリーニングに向けて実験系の構築を進めている。
以上の事から、本研究は順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度が最終年度であるため、以下の計画に従って研究を遂行する予定である。
１）上で述べたように、レポーターシステムを用いる事で、VemP分子内の短い短い疎水性領域が、VemPの翻訳停止の解除に重要な役割を持つ事を示唆する結果を得た。しかしながら、現在のアッセイシステムは、翻訳停止の安定性を直接測定している訳ではない。実際に得られたcis変異により、VemPの翻訳停止状態が不安定化しているかどうかを、代表的な変異体を例にpulse-chase実験により調べる。
２）VemPの翻訳停止に関わる新たなsecY変異の分離を目指して、より高確率で変異の分離が可能な新たなレポーターシステムの構築を目指す。この方法の有用性を確認した後、新たな変異体の分離を進める。
３）VemPの翻訳停止解除の分子機構を明らかにする目的で、ppiD欠失株中で翻訳停止が安定化している状態でのVemPとSecYチャネルとの相互作用を、mono Cys変異体を用いたS-S結合形成により明らかにする。得られた結果に基づき、Arg-85残基と相互作用しうるSecY分子内のアミノ酸残基候補を推定し、そのアミノ酸残基の役割を明らかにすることを目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍の影響により、当初予定していた対面での学会発表が全てオンライン開催となり、成果発表のために計上していた学会参加の為の旅費３０万円の使用がゼロとなってしまった。また、コロナ対策の関係から、実験補助者が研究室に来て実験をする機会を制限した事もあり、その分の金額も少なくなった。
社会的な移動制限も緩和されつつあり、令和４年度は通常通りの研究活動を行う事ができるものと期待している。昨年度に学会発表を行う事のできなかった院生には積極的な参加を促したい。全般的に研究活動を活発化させたい。
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