| 研究課題/領域番号 |
20K06565
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| 研究機関 | 明治薬科大学 |
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研究代表者 |
紺谷 圏二 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (30302615)
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| 研究分担者 |
荒木 信 明治薬科大学, 薬学部, 助教 (20552904)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 低分子量Gタンパク質 / RHEB / RAS / HPLC / 細胞小器官 |
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| 研究実績の概要 |
細胞内において“分子スイッチ”として機能する低分子量Gタンパク質は、ヒトでは150種類以上存在し、不活性型のGDP結合型と活性型のGTP結合型の構造変換を介して、下流のシグナルを制御する。低分子量Gタンパク質群は、一次構造上の特徴から5つのサブファミリー（RAS、RHO/RAC、RAB、ARF/ARL、RAN）に分類され、細胞増殖、細胞骨格、細胞内物質輸送などの制御を行っている。
これまでに低分子量Gタンパク質の活性化状態を解析する手法として、代謝ラベル法による結合グアニンヌクレオチドの解析や、エフェクター分子の相互作用ドメインとGSTの融合タンパク質を用いたGST-pull down assayなどが行われているが、これらの手法は、定量性や汎用性の面で課題が残されている。そこで当該年度の研究において我々は、細胞から免疫沈降法で得られた低分子量Ｇタンパク質に結合したGDP及びGTPを蛍光ラベル化し、それらをHPLCにより定量的に解析することで、低分子量Gタンパク質の活性化状態（GDP 及びGTP結合型の比）を高感度かつ定量的に解析する手法の確立を行った。実験としては、まず蛍光ラベル化試薬DMPG (3,4-dimethoxyphenylglyoxal)を用いたGDP及びGTPの蛍光ラベル化-HPLCの至適条件を検討し、GDP及びGTP共に約5 fmolまで定量可能な実験条件を確立した。この蛍光ラベル化-HPLCの手法を用いて、Hela細胞から免疫沈降により回収した内在性RHEBに結合したGDPおよびGTPを定量することが可能であった。さらに、培地の栄養状態に応じたRHEBのグアニンヌクレオチド結合状態の変化も解析出来ることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
細胞内における低分子量Gタンパク質の活性化状態を解析する場合、これまでの研究では細胞に過剰発現させたものを解析する例が多いが、本研究で確立した手法により、内在性レベルの低分子量Gタンパク質であっても、そのグアニンヌクレオチド結合状態を定量的に解析できることが明らかとなった。ヒトでは150種類以上の低分子量Gタンパク質が知られているが、それらの多くについては細胞内でのグアニンヌクレオチド結合状態は未だ明らかになっていない。本研究での手法はそれらの解析や活性制御機構の解明に有用であることが期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒトにおいて150種類以上存在する低分子量Gタンパク質のうち、約半分は細胞内物質輸送の制御を担うRABやARF/ARLサブファミリーに分類される。細胞内における活性化状態や制御機構の解析が進んでいる一部のRASやRHO/RACなどに比べ、RABやARF/ARLサブファミリーについては、それらに関する知見は限定的である。特に、主にデータベース上で同定されたARL分子群については殆ど解析が進んでいないのが現状である。そこで当該年度で開発した蛍光ラベル化-HPLCの手法を用いて、まず細胞内おけるARLファミリー分子群のグアニンヌクレオチド結合状態を明らかにし、その活性制御機構を解明するための基礎的知見を得る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の研究では、当初の予定よりも遺伝子工学関連および培養細胞関連の実験が少なかったため、予算に差違が生じた。翌年度分として請求した助成金との使用計画としては、本年度の研究で得られた知見を基にして、ARLファミリー低分子量Gタンパク質群を中心にして、各種タグをノックインした細胞を樹立するための実験、及び内在性レベルの発現量でのグアニンヌクレオチド結合状態の解析などを行う予定である。
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