| 研究課題/領域番号 |
20K06571
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
鎌形 清人 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (90432492)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / タンパク質工学 / 単分子計測 / スライディング / 合理的設計 |
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| 研究実績の概要 |
ゲノム編集とは、特殊なDNA結合タンパク質を用いて、遺伝情報を含むDNAを自在に書き換える技術である。将来的に遺伝子治療での使用が期待されるが、編集に時間がかかる、標的ではないDNA配列を誤って編集するなどの問題がある。本研究では、単分子計測とタンパク質工学を組み合わせ、DNAに沿ったスライディング運動を促進させることで、速くて正確なゲノム編集タンパク質を合理的に設計することを目的とした。昨年度、ゲノム編集タンパク質Cas9のスライディング運動を阻害する部位を同定し、DNA結合タンパク質Nhp6Aを対象としてスライディングを促進する部位を同定した。本年度は、上記で得られた知見を用いて、ゲノム編集タンパク質Cas9の改変を行った。第一に、上記で同定したCas9のスライディング阻害部位にアミノ酸変異を加え、DNA上を動けるように設計した。第二に、同定したスライディング促進部位をCas9のN、C末端に付加することで、DNA上をスライディングできるように設計した。これらの改変Cas9を大腸菌で発現させ、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製した。次に、これらのDNA結合タンパク質が持つシステインと蛍光色素のマレイミド基との化学反応により、蛍光色素を修飾した。続いて、DNA整列固定技術「DNAガーデン」と単分子蛍光顕微鏡を用いて、予測通りに改変Cas9がスライディングできるかを検証した。その結果、改変により、Cas9のスライディング運動が約8倍促進することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
【改変Cas9の設計】まず、昨年度同定したCas9のスライディング阻害部位にアミノ酸変異を加え、DNA上を動けるように設計した。次に、同定したスライディング促進部位をCas9のN、C末端に付加することで、DNA上をスライディングできるように設計した。
【改変Cas9の発現と精製と蛍光色素修飾】これらの改変Cas9（8種類）を大腸菌で発現させ、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製した。次に、これらのDNA結合タンパク質が持つシステインと蛍光色素のマレイミド基との化学反応により、蛍光色素を修飾した。
【改変Cas9の性能評価】続いて、DNA整列固定技術「DNAガーデン」と単分子蛍光顕微鏡を用いて、予測通りに改変Cas9がスライディングできるかを検証した。まず、同定したスライディング促進部位をCas9のN、C末端に付加すると、改変Cas9がDNAと共凝集することが分かった。一方で、同定したスライディング促進部位をCas9のC末端のみに付加すると、改変Cas9のスライディング運動が速くなることが分かった。また、DNAとの共凝集は観測されなかった。これらの結果から、スライディング促進部位はCas9のC末端のみに付加することとした。さらに、スライディング阻害部位のアミノ酸置換とスライディング促進部位の付加を組み合わせたところ、Cas9のスライディング運動が改変により最大で約8倍促進することが明らかとなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度に引き続き、改変したゲノム編集タンパク質Cas9の性能の評価を行う予定である。DNA整列固定技術「DNAガーデン」と単分子蛍光顕微鏡を用いて、蛍光色素を修飾した改変Cas9とインターカレータ―で蛍光染色したDNAを同時に観察し、Cas9が編集したDNAの部位を調べる。具体的に、編集の初期反応である“切断”を計測する。標的と標的以外のDNAの切断の割合から、標的を切断する“正確さ”を決定する。このように、DNAの切断個所を調べ、標的と標的以外のDNAの切断の割合から、標的を切断する正確さを評価する。さらに、大腸菌内でのDNA組み換え反応を用いて、改変Cas9が実際に細胞内でDNAの編集を行えるかを検証する。以上より、改変Cas9が予測通りDNA上をスライディングし、短時間でかつ正確に標的DNAのみを切断することを検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【理由】蛍光顕微鏡を1色から2色に改変するために光学部品等の購入を検討していたが、その選定に必要なデータの取得が遅れたため。
【使用計画】光学フィルターやレンズなどの光学部品の購入：100万円、試薬などの消耗品の購入：100万円、論文の掲載費：25万円。
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