| 研究課題/領域番号 |
20K06572
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| 研究機関 | 茨城大学 |
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研究代表者 |
山田 太郎 茨城大学, フロンティア応用原子科学研究センター, 教育研究推進准教授 (40455910)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 中性子タンパク質結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では酵素反応に関わる重要な部分(活性部位)の構造がインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼと類似しているネズミチフス菌由来のノイラミニ ダーゼについて中性子を用いた結晶構造解析を行うことにより、活性部位を構成するアミノ酸残基の水素イオンの有無(プロトン化状態)を可視化して、反応機 構や薬剤の結合状態を明らかにすることを目的としている。2021年度は酵素反応の中間状態を模した阻害剤薬剤DANAとノイラミニダーゼ複合体の中性子結晶構造解析を予定通り実施した。試料は前年と同様の方法で体積が1 立方mmのフリー型のノイラミニダーゼ結晶を調製したのち阻害剤を含む人工母液に浸透した。強度陽子加速器施設(J-PARC)の物質・生命科学実験施設(MLF)に設置されている茨城県生命物質構造解析装置(iBIX)にて中性子回折データを取得した。高エネルギー加速器研究機構のフォトンファクトリーの構造生物ビームラインを用いてX線回折データを取得した。この二つのデータを併用したXN結合精密化を行ったところ、阻害剤DANAの結合に関わる全ての水素結合を明瞭に観察することに成功した。DANAの3位の水素は100%軽水素であることが判明し、複合体中でDANAがプロトン化をうけてカルボカチオン中間体を形成する証拠は見いだされなかった。また提唱されている反応機構からより強い相互作用が存在すると予想していたグルタミン酸残基側鎖とチロシン残基側鎖の酸素原子間の水素結合距離は前年度のHEPES・マロン酸複合体と同様に2.6 オングストロームと短いものの、チロシン残基の水酸基は中性であり特異なプロトン化状態は見られなかった。しかし水酸基の水素は重水素に交換されておりグルタミン酸による脱プロトン化がおこる可能性はあることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2020年度に阻害剤や基質を含まないフリー型のネズミチフス菌由来ノイラミニダーゼのX線・中性子結晶構造解析を行う予定であった。実際に中性子結晶構造解析を行ってみると活性部位に試料調製時に用いたpH緩衝剤が結合していた。インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの場合もこの緩衝剤と複合体を作ることは知られていたが、それとは全く異なる結合様式を持っていることが判明した。結合しているpH緩衝剤やその周りの水素ネットワークを水素原子の位置を含めて決定することができた。また反応に関与するとされているアミノ酸残基のプロトン化状態を決定することができた。
2021年度は予定していたノイラミニダーゼ・阻害剤DANA複合体の中性子結晶構造解析を実施した。体積が1 mm3程度の大型結晶を調製した。試料調製および2021年度B期のJ-PARC・MLFビームタイム共用の開始時期が遅れたことから中性子回折実験の実施時期が２月となった。現在、予定より遅れてデータ処理を行って構造精密化を行っているところである。1.5 オングストローム分解能のデータが取得できたためタンパク質の多くの水素原子が観測されている。DANAとノイラミニダーゼの間の水素結合に関与する水素は全て決定することができた。反応に関与するグルタミン酸、チロシン残基ともに異常なプロトン化状態は見られず、通常の水素結合を形成していた。この結果は前年のpH緩衝剤複合体と同様であった。ノイラミニダーゼ反応機構を調べるという当初目標の達成のためにはフリー型ノイラミニダーゼのX線・中性子結晶構造解析を行う必要があり、これを2022年度に実施する。
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| 今後の研究の推進方策 |
中性子結晶構造解析から得られる水素、水和構造をもとにノイラミニダーゼの反応機構を解明するという本研究の目的を達成するためには薬剤が結合していないフリー状態と反応中間体類似阻害剤複合体の中性子結晶構造解析を完了させる必要がある。まずは2021年度に実施したDANA複合体のX線・中性子結晶構造解析を完了する。2020年度はフリー状態のノイラミニダーゼについて中性子結晶構造解析を行う予定であったが結晶構造解析により酵素の活性部位に試料調製に使用したpH緩衝剤HEPESが結合していることが明らかになった。厳密な議論を行うために、再度、フリー型ノイラミニダーゼの中性子結晶構造解析を行う予定である。2022年度前半にフリー型酵素の調製と大型結晶育成を実施する。X線・中性子回折実験と構造解析は2022年度後半に行う。構造解析により判明したフリー状態と反応中間体類似阻害剤複合体の重要アミノ酸残基のプロトン化状態を比較することにより、ノイラミニダーゼの反応機構を推定する。
その他、2020年度にX線・中性子結晶構造解析により判明したHEPESとノイラミニダーゼの新しい結合様式に関する研究成果についても論文投稿する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2021年度に予定していた研究が比較的順調であったため、これまでに購入していた試薬や物品を使って行うことができた。また、新型コロナ感染症のため国内および国際学会はすべてオンライン形式で行われたため旅費を使用することがなかった。2022年度にフリー型ノイラミニダーゼ の試料調製に使用する試薬やプラスチック消耗品の購入を行うことを予定している(700千円）。また中性子・X線回折実験に必要な消耗品やサンプルホルダー等の購入を行う予定である(700千円）。論文作成や発表資料を作成するための計算機一台とモニターを購入する予定である（各100千円未満）。成果発表のためにオンサイトで行われる国内学会に参加するための旅費(200千円）と論文投稿に必要な諸経費(200千円）を見込んでいる。
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