| 研究課題/領域番号 |
20K06590
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
木下 祥尚 九州大学, 理学研究院, 助教 (40529517)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 脂質ラフト / 局所麻酔薬 / 蛍光共鳴エネルギー移動 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は本研究を遂行する基盤となる、脂質ラフトの形成/崩壊を評価する手法の確立を試みた。これまでラフトの形成/崩壊を評価できなかった主たる原因は、ラフトを標識できる適切なプローブが欠落していたからである。そこで、申請者らが開発したラフトに局在する脂質(sphingomyelin; SM)の分布や拡散挙動を高精度で模倣する蛍光SMプローブを用いてこの問題を解決した。
具体的には異なる蛍光物質で標識した二種類のSMプローブを細胞膜に導入し、その間に生じる蛍光エネルギー移動(FRET)効率を指標にすることで、ラフトの形成/崩壊を評価した(以下では、脂質間FRET法と呼ぶ)。SMがラフトに局在することを勘案すると、ラフト存在下ではFRETが効率的に生じるのに対し、ラフトが崩壊するとSMが膜表面に均一分散するので、FRET効率は減少するはずである。実際の細胞膜で形成される脂質ラフト(< 200 nm)は小さく顕微鏡で可視化できないが、細胞膜全体から得られる脂質間FRETを検出することでラフトの形成/崩壊が評価できる。
まず、脂質間FRET法がラフト形成/崩壊の評価において有用であることを、大量調整が可能である赤血球ゴースト膜を用いて調査した。実際、FRETペアを導入した赤血球膜に対大して、ラフト阻害剤として汎用されているシクロデキストリンを添加したところ、予想通り脂質ラフトに局在していたSMプローブが膜内に分散し、FRET効率が減少することが分かった。この結果は、脂質間FRET法がラフトの形成/崩壊を評価するために有用であることを示唆している。さらに、代表的局所麻酔薬であるジブカインを添加したところ、FRETが減少し、ラフトの形成が阻害されていることが明らかになった。今後はこの手法を実際の神経芽腫細胞(Neuro2Aなど)に応用し、局所麻酔薬がラフト阻害を引き起こすことを確認する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は脂質間FRET法が脂質ラフトの形成/崩壊を評価するために有用であることをシクロデキストリンを用いた手法で確認した。環状化合物であるシクロデキストリンはコレステロールをその内部に取り込むことで、細胞膜から抽出できる。コレステロールはラフトの主要構成成分であるため、シクロデキストリンは代表的ラフト阻害剤として幅広く利用されてきた。
本研究では大量に入手することができる赤血球ゴースト膜をFRETペアを形成する二色のSMプローブで標識し、それに対して外部からシクロデキストリンを加えたときのFRET効率の変化を調査した。予想通りシクロデキストリン存在下では脂質ラフトが崩壊し、SMプローブが膜内に分散し、その結果FRET効率が顕著に減少することが分かった。このことは脂質間FRETはラフトの形成/崩壊を評価するための有益な手法であることを示している。さらに代表的局所麻酔薬であるジブカインをFRETペアで染色した赤血球ゴースト膜に添加したところ、シクロデキストリンと同様にFRET効率が減少し、ラフトの形成が阻害されていることが明らかになった。これは、申請者らが提唱する麻酔作用発現のメカニズム「脂質ラフト媒介仮説」を指示する結果である。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では、大量入手が可能である赤血球膜を用いて、脂質間FRET法がラフトの形成や阻害を評価できることを確認した。また、代表的局所麻酔薬であるジブカインがラフト形成を阻害することを明らかにした。この結果を礎に次年度は以下の研究を行う。
(1)脂質間FRET法を実際の神経芽腫細胞(Neuro2Aなど)に適用し、局所麻酔薬存在下でラフトが阻害されることを確認する。(2)麻酔効力の異なる複数の局所麻酔薬を用いて、麻酔効力とラフト阻害能の相関を明らかにする。これにより、申請者らが提唱するラフト媒介仮説をより強固なものにする。
さらに、ラフト阻害が神経伝達を遮断するメカニズムについても調査する必要がある。すなわち麻酔作用発現の引き金となるのはイオンチャネルであることを勘案すると、ラフトの構造変化がチャネルの活性とどのように相関するかを検討することは不可欠である。最終年度、シクロデキストリンを用いて脂質ラフトを破壊したときに、イオンチャネルの活性がどのように変化するかについても調査し、神経伝達阻害と脂質ラフトの形成/崩壊の相関を検討する。
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