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2020 年度 実施状況報告書

TIRF観察による細菌アクチンMreBの重合ダイナミクスと阻害剤A22の作用理解

研究課題

研究課題/領域番号 20K06591
研究機関大阪市立大学

研究代表者

藤原 郁子  大阪市立大学, 大学院理学研究科, 助教 (10742075)

研究期間 (年度) 2020-04-01 – 2023-03-31
キーワードMreB / 重合 / ATP加水分解メカニズム / スピロプラズマ / MreB繊維の可視化
研究実績の概要

A22によるMreB阻害メカニズムを明らかにすべく、まず、対象とする細菌のもつMreB(スピロプラズマ由来のMreB(SMreB))の機能を調べた。スピロプラズマには5つのMreBがあるが、そのうち最も大量に発現するものと、ATP加水分解が他より著しく遅いものに注目し、重合ダイナミクスについて調べた。ATP加水分解が遅いMreBの結晶構造解析から、加水分解に重要な枠割を果たすアミノ酸の部位を同定できた。これはアクチンにおける加水分解メカニズムと同じ機構であり、真核・バクテリアを超えてATP加水分解の機構が保持されていることを明らかにした。また同じスピロプラズマ内のMreBでも、束化するものとしないものがあることが分かった。
さらに、なぜスピロプラズマのみ5つもMreBを有するのかを調べる為、MreBの系統学について調べた。これらの成果は、国際誌1報、国内学会ワークショップ1回、ポスター発表4回にて国内外に発表し、活発な研究活動を行っている。

Alexa488で蛍光ラベルしたMreB繊維をTIRF下で観察を試みた。この実験にスピロプラズマ由来のMreB (SMreB)を2つ用いたところ、観察可能な長さのMreBが形成されなかった。負染色して電顕下でMreB繊維を観察したところ、今回用いた2種のSMreBは、どちらも短い繊維を形成した。この成果は、国内学会ワークショップで1回で発表した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

コロナ禍により、研究室へのアクセスが制限されたため、数か月の遅延が生じた。
さらにMreBが突然に発現しなくなるという想定外のアクシデントが生じたが、試行錯誤の上にVectorと大腸菌株を変えることで修復できた。

以上のトラブルの対応には約4か月要したものの、その後に実験速度を上げることで結果につなげることができた。

今後の研究の推進方策

SMreBはATPがない状態でも繊維化することが分かり、A22の影響と重合の相関を調べるには適さないMreBであることが示唆された。今後は、A22の影響が顕著に分かるMreBに着目して研究を進める。

次年度使用額が生じた理由

蛍光MreB繊維が形成されなかったことから、高倍率の対物レンズを買う以前に、実験条件の検討を行っている。またコロナ禍で旅費が使用されなかったために使用予定金額に変更があった。
今年度は、申請者の所属が変わったことにより、装置系の見直しの必要があること、また本人と学生の大阪市大までの移動費として計上を予定している。

  • 研究成果

    (9件)

すべて 2021 2020

すべて 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 1件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 2件)

  • [雑誌論文] Crystal structure of human V-1 in the apo form2021

    • 著者名/発表者名
      Takeda Shuichi、Koike Ryotaro、Nagae Takayuki、Fujiwara Ikuko、Narita Akihiro、Ma?da Yuichiro、Ota Motonori
    • 雑誌名

      Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications

      巻: 77 ページ: 13~21

    • DOI

      10.1107/S2053230X20016829

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Phylogenetic origin and sequence features of MreB from the wall-less swimming bacteria Spiroplasma2020

    • 著者名/発表者名
      Takahashi Daichi、Fujiwara Ikuko、Miyata Makoto
    • 雑誌名

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      巻: 533 ページ: 638~644

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2020.09.060

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Myosin 18Aα targets the guanine nucleotide exchange factor β‐Pix to the dendritic spines of cerebellar Purkinje neurons and promotes spine maturation2020

    • 著者名/発表者名
      Alexander Christopher J.、Barzik Melanie、Fujiwara Ikuko、Remmert Kirsten、Wang Ya‐Xian、Petralia Ronald S.、Friedman Thomas B.、Hammer John A.
    • 雑誌名

      The FASEB Journal

      巻: 35 ページ: e21092

    • DOI

      10.1096/fj.202001449R

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] D-Loop Mutation G42A/G46A Decreases Actin Dynamics2020

    • 著者名/発表者名
      Matsuzaki Mizuki、Fujiwara Ikuko、Kashima Sae、Matsumoto Tomoharu、Oda Toshiro、Hayashi Masahito、Maeda Kayo、Takiguchi Kingo、Ma?da Yuichiro、Narita Akihiro
    • 雑誌名

      Biomolecules

      巻: 10 ページ: 736~736

    • DOI

      10.3390/biom10050736

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Development of Spiroplasma swimming motor from bacterial actin MreB2021

    • 著者名/発表者名
      Daichi Takahashi、Ikuko Fujiwara, Makoto Miyata
    • 学会等名
      BLAST XVI online
    • 国際学会
  • [学会発表] Polymerization of bacterial actin MreB involved in swimming mitility of Spiroplasma eriocheiris2021

    • 著者名/発表者名
      Daichi Takahashi、Ikuko Fujiwara, Makoto Miyata
    • 学会等名
      BLAST XVI online
    • 国際学会
  • [学会発表] 螺旋推進する細菌スピロプラズマ内のアクチン様タンパク質MreBの重合観察2020

    • 著者名/発表者名
      Ikuko Fujiwara, Daichi Takahashi, Yuhei O. Tahara, Yuya Sasajima, Hana Kiyama, Makoto Miyata
    • 学会等名
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ 2020 Online
  • [学会発表] 細菌アクチンMreBからスピロプラズマ遊泳モーターへの進化2020

    • 著者名/発表者名
      Daichi Takahashi, Ikuko Fujiwara, Makoto Miyata
    • 学会等名
      第58回日本生物物理学会年会 オンライン開催
  • [学会発表] Structures and dynamics of bacterial actin homolog, mreB proteins involved in swimming motility ofSpiroplasma eriocheiris2020

    • 著者名/発表者名
      Daichi Takahashi, Ikuko Fujiwara, Katsumi Imada, Makoto Miyata
    • 学会等名
      第20回日本タンパク質k学会年会 オンライン開催

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公開日: 2021-12-27  

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