| 研究課題/領域番号 |
20K06596
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| 研究機関 | 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所) |
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研究代表者 |
佐藤 薫 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究員 (20548507)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | piRNA / PIWI / ヘテロクロマチン / 生殖細胞 / トランスポゾン |
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| 研究実績の概要 |
piRNAは生殖組織特異的に産生される小分子RNAであり、トランスポゾンの発現を負に制御することで、それらのゲノムへの侵略を防ぎ、生殖ゲノムの品質管理を担う。piRNA産生に異常が生じると不稔となり、種の保存は成立しなくなる。piRNAは、piRNAクラスターと呼ばれるトランスポゾン断片が集積したゲノム領域から転写される。ショウジョウバエ卵巣では特に、Dual-strandクラスターと呼ばれるpiRNAクラスターが活性化しており、そのゲノム領域はヘテロクロマチンヒストンマークH3K9me3に富むが、HP1aパラログであるRhiタンパク質が相互作用することで転写が活性化されている。しかし、その転写活性化の作用機序は不明な点が多く、さらに、そもそもどのようにRhiがDual-strandクラスターのH3K9me3を特異的に認識しているのかはまったく明らかになっていない。本研究では、それらの仕組みを明らかにするために、Rhiが発現してない培養細胞を用いたゼロベースでのゲノム条件下においてRhiおよび核内piRNA因子群を異所的に発現させた人工的な実験系を用いて、①Rhi相互作用ゲノム部位の同定、および、②Dual-strandクラスターの転写活性化に最低限必要な遺伝子セットの同定、③Rhi相互作用ゲノム部位のクロマチン状態変化の解明を行う。以下に、本研究の進捗と今後の予定について述べる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①Rhi相互作用ゲノム部位の同定
これまで、Rhiが発現してない培養細胞OSCを用いて、Rhiタンパク質をプラスミドトランスフェクションにより強制発現させ、クロマチン免疫沈降（ChIP）を進めていたが、その解析では明確なピーク（シグナル）が得られなった。そこで、プラスミドトランスフェクションによる一時的な発現ではなく、Rhiの安定発現細胞株の作成を進めた。現在、いくつかのモノクローナル細胞を樹立し、Rhiの安定発現が検出できている。今後ChIP解析を進めていきたい。
②Dual-strandクラスターの転写活性化に最低限必要な遺伝子セットの同定
Dual-strandクラスターの発現には、Rhi、Del、CuffのRDC複合体に加えて、Moon/TRF2/TFIIA-Sが関与するとされる。これまでの解析で、OSCと卵巣のRNA-seqデータを比較したところ、OSCにおいてRhiとMoonの発現がほとんどみられず、それ以外のタンパク質については卵巣と同程度に発現していることが分かった。また、Rhiは卵巣、OSCにおいて核内顆粒状局在を示すが、Delを共発現させるとよりシャープな顆粒が形成されたことから、RhiとMoon に加えて、Delを共発現させることでDual-strandクラスターの発現がみられるようになると考えられる。Rhiの核内顆粒状局在と、piRNAクラスターの位置関係を明らかにするために、OSCにおけるpiRNAクラスターのFluorescent in situ Hybridization (FISH)を立ち上げ、Rhiの局在を調べた結果、大きなシグナルの一致はみられなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
①Rhi相互作用ゲノム部位の同定
OSCにおいて、Rhiを恒常的に発現する安定発現細胞株を作成した。今後、作成した安定発現株を用いて、RhiのChIP解析を行い、Rhi相互作用ゲノム部位の同定を行う予定である。また、RhiとDelを強制発現した場合、Rhi単体の強制発現よりもより強い細胞内顆粒状局在がみられるため、Delも同時に発現する安定発現株を作成することでChIPのシグナルの強化、変化が見込まれるかもしれないため、そちらについても検討したい。
②Dual-strandクラスターの転写活性化に最低限必要な遺伝子セットの同定
OSCにおいて、piRNAクラスターのFluorescent in situ Hybridization (FISH)を行い、Rhiの局在を調べた結果、大きなシグナルの一致はみられなかった。Rhiの局在は卵巣異なり、piRNAクラスターに依存したものではない可能性が示唆された。今後、同時にDel、Moonを共発現させ、piRNAクラスターのFISHを行い、Rhiの核内顆粒局在との共局在性を調べていきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
いくつかのChIP-seq, RNA-seqなどを計画していたものが条件検討などに注力する必要がでたため、次年度使用に変更した。また、併せて、それらの解析に使用するワークステーションを導入する予定で合ったが、コロナによる世界的な半導体の生産遅延などの影響で非常に高騰していたため、次年度使用へ変更した。
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