| 研究課題/領域番号 |
20K06596
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| 研究機関 | 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所) |
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研究代表者 |
佐藤 薫 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究員 (20548507)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | piRNA / Piwi / piRNAクラスター / ヘテロクロマチン / ヒストン / エピジェネティクス |
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| 研究実績の概要 |
piRNAは生殖組織特異的に産生される小分子RNAであり、トランスポゾンの発現を負に制御することで、それらのゲノムへの侵略を防ぎ、生殖ゲノムの品質管理を担う。piRNA産生に異常が生じると不稔となり、種の保存は成立しなくなる。piRNAは、piRNAクラスターと呼ばれるトランスポゾン断片が集積したゲノム領域から転写される。ショウジョウバエ卵巣では特に、Dual-strandクラスターと呼ばれるpiRNAクラスターが活性化しており、そのゲノム領域はヘテロクロマチンヒストンマークH3K9me3に富むが、HP1aパラログであるRhiタンパク質が相互作用することで転写が活性化されている。しかし、その転写活性化の作用機序は不明な点が多く、さらに、そもそもどのようにRhiがDual-strandクラスターのH3K9me3を特異的に認識しているのかはまったく明らかになっていない。
本研究では、それらの仕組みを明らかにするために、Rhiが発現してない培養細胞を用いたゼロベースでのゲノム条件下においてRhiおよび核内piRNA因子群を異所的に発現させた人工的な実験系を用いて、①Rhi相互作用ゲノム部位の同定、および、②Dual-strandクラスターの転写活性化に最低限必要な遺伝子セットの同定、③Rhi相互作用ゲノム部位のクロマチン状態変化の解明を行う。以下に、本研究の進捗と今後の予定について述べる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①Rhi相互作用ゲノム部位の同定
これまで、Rhiが発現してない培養細胞OSCを用いて、Rhiの安定発現細胞株の作成を進めた。いくつかのモノクローナル細胞を樹立し、Rhiの安定発現が検出できた。今後、ChIP解析を進めていきたい。また、組み換えRhiタンパク質を用いて、親和性の高いヒストン修飾について、ペプチドアレイスクリーニング法を用いて調べ、いくつかのヒストン修飾を明らかにした。
②Dual-strandクラスターの転写活性化に最低限必要な遺伝子セットの同定
Dual-strandクラスターの発現には、Rhi、Del、CuffのRDC複合体に加えて、Moon/TRF2/TFIIA-Sが関与するとされる。これまでの解析で、OSCと卵巣のRNA-seqデータを比較したところ、OSCにおいてRhiとMoonの発現がほとんどみられず、それ以外のタンパク質については卵巣と同程度に発現していることが分かっている。また、Rhiは卵巣、OSCにおいて核内顆粒状局在を示すが、Delを共発現させるとよりシャープな顆粒が形成されたことから、RhiとMoon に加えて、Delを共発現させることでDual-strandクラスターの発現がみられるようになると考えられる。OSCにおけるRhi依存的なDual-strandクラスターの発現誘導の組み合わせと定量的な発現誘導量の解析を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
①Rhi相互作用ゲノム部位の同定
OSCにおいて、Rhiを恒常的に発現する安定発現細胞株を作成した。今後も引き続き、作成した安定発現株を用いて、RhiのChIP解析を行い、Rhi相互作用ゲノム部位の同定を進める予定である。また、RhiとDelを強制発現した場合、Rhi単体の強制発現よりもより強い細胞内顆粒状局在がみられるため、Delも同時に発現する安定発現株を作成することでChIPのシグナルの強化、変化が見込まれるかもしれないため、そちらについても進める。また、ヒストンペプチドアレイを用いたスクリーニングにより明らかにしたRhiの親和性の高いヒストン修飾についてもゲノムワイドな解析を進めていく。
②Dual-strandクラスターの転写活性化に最低限必要な遺伝子セットの同定
今後、引き続き、OSCにおいて、Dual-strand piRNAクラスターの転写活性化に必要な遺伝子セットの検討を進めていく。また、OSCでのRhiの局在が卵巣と異なる可能性や、Dual-strand piRNAクラスターのゲノム位置に依存したものではない可能性も考慮しつつ、Rhiの核内顆粒局在とRhiが親和性を示すヒストン修飾との関係を調べていきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
一部のChIP-seq, RNA-seqなどを計画していたものが条件検討などに注力する必要がでたため、次年度使用に変更した。
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