研究課題
申請者は2C-ES-TS細胞間でのHi-C解析結果の比較から、2Cでは染色体間相互作用の割合が高いことを見出した。さらにこの染色体間相互作用によって、2Cには、ESやTS細胞では見られない、ゲノムの特定の領域を基点とした高次構造が形成されていることを見出した。マッピング結果から、この高次構造はゲノムの多数の領域がrDNA領域と相互作用して形成されていると考えられた。マウスをモデルとして検出された2C特異的なこの核内高次構造が全能性細胞において、またその後の発生においてどのような役割を担っているのか検証するため、（１）生細胞蛍光イメージング法による核内ゲノム動態の観察、（２）2C特異的な核内高次構造形成に寄与しているタンパク質の同定とその生理機能解析を行う予定である。まず（１）については、rDNA領域と相互作用している配列の核内蛍光イメージングを試みている。dCas9-mCherry mRNAを標的配列に対するgRNAとともに受精卵にインジェクションし、2CにおいてmCherryのシグナルの検出を試みているが、マニピュレーターによるインジェクションがうまくいかず、結果を得るまでには至っていない。一方、（２）については、rDNAに集結していた配列情報から、モチーフ解析などによりこの2C特異的な核内高次構造形成に寄与している可能性のあるタンパク質の推定を試みた。その結果、Cux1が有意にenrichしていたことから2CでのCux1タンパクの細胞内局在状況を見たところ、核小体への集結がみとめられた。そこで、このCux1についてはCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集によるノックアウトを試みた。このCux1ノックアウトマウスは、現在までホモ個体が生まれてきておらず、胎生致死となっていると考えられる。今後、発生のどの段階で致死となっているのかを検証する。
2: おおむね順調に進展している
項目（１）については技術的な問題により難航しているが、項目（２）の2C特異的な核内高次構造形成に寄与しているタンパク質の同定とその生理機能解析について、2C特異的な核内高次構造形成に寄与している可能性のあるタンパク質としてCux1を抽出し、Cux1タンパク質の2Cでの細胞内（核内）分布を確認した。さらに、ゲノム編集によりCux1タンパク質のノックアウトマウスを作出しており、興味深い表現型もみられている。
昨年度に引き続き、rDNA領域と相互作用している配列の核内蛍光イメージングを進める。まずはマニピュレーションをきちんと習得し、胚の生存率を高める。さらに、Cux1ノックアウトマウスの致死時期の特定を進める。
昨年からのコロナの蔓延により、予定していた出張は全てオンラインでのミーティングで行うことになった。さらに、2020年1月から近畿大学生物理工学部に異動したことで、実験環境は大幅に変わり、実験機器の自由な使用が難しくなった。そこで、コロナ禍で支出できなかった出張費を設備費に流用して実体顕微鏡を購入し、学生達とは別に実験を行えるように環境を整えたが、わずかながら次年度使用額が残ってしまった。残額は、昨年度に引き続いて行う免疫染色のための抗体購入か、gRNA購入にあてる予定である。
すべて 2020
すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 3件)
J Biochem.
巻: mvaa125 ページ: -
10.1093/jb/mvaa125
J Reprod Dev.
巻: 66 ページ: 369-375
10.1262/jrd.2019-164
巻: 66 ページ: 359-367
10.1262/jrd.2020-026
