| 研究課題/領域番号 |
20K06608
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
亀谷 将史 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (80748517)
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| 研究分担者 |
石井 正治 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (30193262)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | TCA回路 / rTCA回路 / 代謝複合体 / 炭酸固定 |
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| 研究実績の概要 |
代謝酵素複合体とは、ある代謝系を構成する酵素群が細胞内で形成する複合体である。多くの生物の代謝の根幹として機能するTCA回路においても代謝酵素複合体が形成されることが知られているが、その進化的起源は明らかになっていない。
本研究では、TCA回路を逆回転させた二酸化炭素固定経路、reductive TCA (rTCA)回路における複合体形成の有無やその機能を明らかにする。これにより、炭酸固定というエネルギー的に不利な代謝を進めるために複合体形成が寄与しているかを明らかにすると共に、rTCA回路酵素を用いた物質生産に資する知見を得る。さらに、rTCA回路がTCA回路の祖先型代謝であるという進化的関係に着目し、rTCA回路にとどまらずTCA回路の代謝酵素複合体の起源を明らかにし、生物普遍的な中央代謝系であるTCA回路の進化過程全貌の理解を目指す。
これまでに、細胞抽出液の分画による複合体形成の検出を試みた。rTCA回路を有する微生物Hydrogenobacter thermophilus TK-6を培養し、その細胞抽出液を調製後、ゲル濾過カラムなどによる分画を行った。得られた過分を用い、rTCA回路を構成する各種酵素の活性を測定を行い、高分子画分で複合体と推測される活性が検出されるかを検証した。また、各酵素に特異的な抗体を作製し、Western blottingによる高感度検出を可能とした。さらに、rTCA回路中の酵素にアフィニティ精製タグを付けて発現させ、それと複合体を形成するタンパク質の取得を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに細胞抽出液の分画による複合体形成検出実験を終えた。さらに個々の酵素に特異的な抗体を作製し、Western blottingによる高感度検出を可能とした。さらに、rTCA回路中の酵素にアフィニティ精製タグを付けて発現させ、それと複合体を形成するタンパク質の取得を進めている。また、rTCA回路中の酵素にアフィニティ精製タグを付けて発現させるための組換え用のプラスミドを作製にも成功し、いずれの酵素でも活性型酵素が得られた。これら抗体と組換え酵素を組み合わせ、複合体を形成するタンパク質の検出・取得を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
アフィニティ精製タグを付加した組換えタンパク質を用い、in vitroでの複合体形成の有無を確かめる実験を進める。Western blottingによる高感度検出に加え、MALDI TOF-MSによる解析などでそのタンパク質同定を進め、複合体形成に関与するタンパク質の同定を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験に必要な試薬類は研究室の在庫でまかなえたため、次年度に使用する試薬や実験器具などに必要な物品の購入に充てる予定である。
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