| 研究課題/領域番号 |
20K06616
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
春田 奈美 東北大学, 生命科学研究科, 助教 (70381671)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 微小管 / γ-チューブリン複合体 / C.elegans |
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| 研究実績の概要 |
細胞内の微小管ネットワークは、細胞分裂時の紡錘体形成や細胞の形態形成など、細胞の種類及び時期特異的に形成され、細胞の分化にも密接に関与する。本研究では、組織特異的な微小管ネットワークの構築と制御を明らかにするため、線虫Caenorhabditis elegansの生殖線内の生殖細胞系列の発達における微小管動態についてその制御メカニズムの解明に取り組んでいる。微小管ネットワークは、主に微小管の形成中心(MTOC)から形成されるが、MTOCの主要な構成因子が微小管の末端に結合し、微小管の形成と繋留を行うγ-チューブリン複合体(γ-TuC)である。我々はこれまでにC. elegansのγ-TuCの新規構成因子であるGTAP-1, GTAP-2を同定し、中心体および生殖腺における役割を解析してきた。gtap-1変異体は、シンシチウム構造をもつ雌雄同体の生殖腺の構造異常の表現型がみられ、産卵数の低下および胚生致死率が加齢依存的に上昇することを見出している。さらにgtap-1gtap-2の二重変異体では著しい生育異常と産卵数の低下を確認している。
本年度は、γ-TuCの生殖腺特異的なMTOCへのリクルート因子の探索を行うことを目指し、生殖腺形成に影響がある候補遺伝子に関して網羅的なRNAiスクリーニングを行い、生殖膜上のγ-チューブリンの局在量を定量的に調べた。その結果、いくつかの遺伝子については生殖腺構造への影響は強いものの、γ-チューブリンの局在量がgtap-1やgtap-2変異体よりもより減少させる遺伝子は見つからなかった。そこでγ-TuCの細胞内で共局在する因子を同定するTurboID法を導入した。
またC. elegansにおいて時期および組織特異的な効率的なノックダウンを行いその表現型を観察するために、改良されたAID（オーキシン誘導性標的タンパク質分解法）法を導入した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、gtap-1やgtap-2変異体の表現型観察をγ-TuCと共同的に働くと示唆されているnoca-1遺伝子やアクトミオシンとの関連性の観点から調べた。
またγ-チューブリン複合体を生殖腺の膜上へリクルートする因子の探索を進めてきた。RNAiの網羅的なスクリーニングは完了し、さらに生殖腺膜上でγ-TuCと共局在するタンパク質を探すために、TurboID法を導入した。TurboID法は、標的タンパク質にビオチン付加酵素を融合し、細胞内で近接したタンパク質をビオチン化させる。ビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジン結合ビーズで精製し、マス解析で同定することで、近接に集積しているタンパク質群を明らかにできる。そこで生殖腺膜上に局在しγ-TuCと機能的な相関が示唆されているNOCA-1タンパク質にビオチン付加酵素を融合した株を作成した。この融合タンパク質は、生殖腺膜上に特異的に局在していることを確認している。さらにストレプトアビジン結合ビーズを用いた精製を行い、γ-TuCの関連因子がビオチン化されていることを確認しているので、現在はこの精製試料を用いてマス解析を行う段階である。
さらに時期および組織特異的なノックダウンを効率的に行うためにAID法を改良し、ノックダウンの条件検討を行ってきている。表現型観察とγ-TuCのMTOCへのリクルート因子の探索、株の作成など多少の実験計画の変更はあったものの概ね順調に進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず現在進行中であるTurboID法を用いた生殖腺膜上に集積するタンパク質群のマス解析を行い、γ-TuCの生殖腺膜上MTOCへのリクルートに関連する候補因子を絞り込む。候補因子は、コードする遺伝子のRNAiによるノックダウンを行い、生殖腺形態、γ-TuCの生殖腺膜上の局在量および微小管動態等について表現型観察を行う。顕著な表現型を得た遺伝子に対しては、さらにGFP融合タンパク質を生殖腺特異的に発現する株を作成し、その細胞内局在とγ-TuCとの物理的な相互作用について検討を行う予定にしている。この解析から、γ-TuCが生殖腺膜上MTOCへ局在するメカニズムが明らかにできるのではないかと考えている。
また時期および組織特異的なノックダウンを行うために、組織特異的なプロモーター下で改良型TIR1と蛍光標識した微小管やヒストンを同時に発現する株を作成し、GTAP-1::AID株を掛け合わせる。この株を用いて、GTAP-1をノックダウンしてからの微小管の細胞内動態を時間とともに追跡する予定にしている。さらにgtap-1とgtap-2の二重変異株は、著しい生育異常と産卵数の減少がみられるが、世代を通じての影響が大きいため、その原因となる分化時期がはっきりしない。そこで、影響がほとんどみられないgtap-2変異体株下で、細胞種および時期特異的にGTAP-1をノックダウンすることでGTAP-1とGTAP-2が冗長的に働いている時期を解析する。これらの解析から、γ-TuCの構成因子が、どのように細胞種や時期特異的に機能を使い分けているかが明らかにできるのではないかと期待している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該助成金が生じた主要な理由は、コロナ感染症流行により、前年度に引き続いてオンラインでの学会および研究会の参加のみとなったため、出張費の分が差額となった。
本年度は、現地での学会開催が増加しつつあるため、研究成果の発表と最新知見の収集のため学会の参加および出張費として使用する予定である。また論文発表んための英文校正と投稿費の一部にも充てる予定にしている。
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