| 研究課題/領域番号 |
20K06625
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
西村 珠子 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (40415261)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | BARタンパク質 / 細胞間接着 |
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| 研究実績の概要 |
上皮細胞は、隣接する同種細胞との間に細胞間接着を形成する。しかしながら、細胞間接着の形成における細胞膜の役割については不明な点が多い。BARファミリータンパク質は、二量体で脂質膜に結合して、かつ多量体を形成することにより、膜の形態を制御する。BARタンパク質サブファミリーのひとつであるI-BARタンパク質は、突出膜の形成を制御する。しかしながら、細胞間接着の形成・維持におけるI-BARタンパク質の関与は明らかでない。そこで、I-BARタンパク質が細胞膜の突起構造を形成し、細胞間接着の形成を制御する分子メカニズムを検討した。
I-BARタンパク質をダブルノックアウトしたCaco2細胞で細胞間接着分子の分布を調べたところ、野生型およびシングルノックアウトと比較して密着結合の直線性が更に低下した。また、I-BARタンパク質をダブルノックアウトした細胞の細胞層で、野生型およびシングルノックアウトと比較して細胞層の透過性が更に上昇した。また、I-BARタンパク質の遺伝子上流にmVenusをノックインしたCaco2細胞株において、免疫沈降物のMS解析を行ったところ、細胞移動およびがんの悪性化を抑制する細胞間接着制御分子との相互作用が検出された。
現在、蛍光ラベルした密着結合タンパク質を野生型、シングルノックアウト、ダブルノックアウト細胞に安定発現するCaco2細胞、およびノックアウト細胞に蛍光ラベルしたI-BARタンパク質を安定発現したCaco2細胞を作製中であり、細胞株を取得したならばライブイメージングおよびCLEM観察を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
I-BARタンパク質のダブルノックアウト細胞を作製して、そのフェノタイプを調べた。また、I-BARタンパク質遺伝子上流にmVenusをノックインしたCaco2細胞株で免疫沈降およびMS解析を行って相互作用分子を同定した。現在、野生型、シングルノックアウト、ダブルノックアウト細胞に蛍光標識した密着結合タンパク質を発現した安定発現株や、ノックアウトのレスキュー細胞株を作製中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度の研究成果に基づき、更なる発展を図る。例えば、I-BARタンパク質ノックアウトによる密着結合の直線性低下および細胞層の透過性亢進のメカニズムを、ライブイメージングや電顕観察等により明らかにする。また、細胞間接着におけるI-BARタンパク質の詳細な分布を、超解像顕微鏡で明らかにする。これらの成果を論文にまとめ、学術誌に投稿する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
これまでに研究を効率的に、かつ試薬購入を計画的に進めた結果、直接経費を予定よりも節約することができた。次年度の実験計画において、抗体やsiRNAを各々複数個購入する必要が見込まれるため、翌年度分の助成金と合わせて効率的かつ計画的に使用する予定である。
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