| 研究課題/領域番号 |
20K06628
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
小迫 英尊 徳島大学, 先端酵素学研究所, 教授 (10291171)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | PINK1 / Parkin / パーキンソン病 / ミトコンドリア / プロテオーム / 質量分析 / 免疫沈降 / 絶対定量 |
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| 研究実績の概要 |
家族性パーキンソン病の原因遺伝子産物であるセリン/スレオニンキナーゼPINK1とユビキチン連結酵素Parkinが協調して損傷ミトコンドリアをオートファジーによって特異的に除去する分子機構の概要が最近明らかになった。しかしながら、従来の細胞生物学や分子生物学を基盤とする研究からは、その全体像を理解する上で十分な知見が得られていない。特に損傷ミトコンドリアの外膜上で安定化し蓄積したPINK1が形成する複合体の構成因子を大規模に明らかにするためには、高度なプロテオーム解析技術が必須である。これまでに免疫沈降-質量分析（IP-MS）法を改良・最適化することにより、既知のPINK1結合因子であるTOM複合体構成因子だけでなく、TIM複合体構成因子であるTIM23を新たなPINK1結合因子として見出した。TIM23はPINK1と相互作用することによってミトコンドリア内膜のプロテアーゼによるPINK1の分解を防ぐ役割を担っていることが示唆された。そこで本年度は、PINK1の免疫沈降物中に含まれるTIM23を絶対定量することを試みた。PINK1およびTIM23由来のトリプシン消化ペプチドに相当する、安定同位体で標識したAQUAペプチドを３本ずつ合成した。脱共役剤で処理した細胞から調製したPINK1の免疫沈降物にこれらのAQUAペプチドを200 fmolずつスパイクしてトリプシン消化後、PRM法を用いたターゲット質量分析による定量解析を行った。その結果、PINK1の約1/5量のTIM23が共免疫沈降していることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
免疫沈降-質量分析法の確立により、PINK1との新たな相互作用因子としてミトコンドリア内膜に局在するTIM23を同定することができた。このIP-MS法は他の標的タンパク質との相互作用タンパク質を大規模同定する際にも適用可能な汎用性の高い方法である。また、PINK1の免疫沈降物中のPINK1とTIM23の絶対量をAQUAペプチドとPRM法によって定量することに成功した。これによりミトコンドリア内膜のプロテアーゼによるPINK1の分解をTIM23が防ぐモデルを支持することができたため、本研究の進捗状況はおおむね順調と判断される。
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| 今後の研究の推進方策 |
ミトコンドリアの損傷を検知するセンサーであるPINK1が形成する複合体の構成因子を大規模に同定することにより、新たなPINK1との相互作用因子によるPINK1の安定性の制御機構を見出すことができた。近年開発された相互作用因子の同定法である近接ビオチン標識法も実施することにより、PINK1複合体の構成因子をさらに大規模に同定する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
AQUAペプチドとPRM法による絶対定量の実験はこれまで経験がなかったために試行錯誤することが予想されたが、実際には１回目の実験で良好な結果が得られたため、当該実験にかかる費用が当初予定よりも少なくなり、次年度使用額が生じた。次年度に持ち越した研究費は近接ビオチン標識法によるPINK1との相互作用因子の同定のための費用と、これらの解析を担当する技術職員の人件費等に使用する予定である。
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