| 研究課題/領域番号 |
20K06655
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
荒巻 敏寛 大阪大学, 生命機能研究科, 助教 (30525340)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | サイズスケーリング / 細胞膜電位 |
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| 研究実績の概要 |
これまでの研究で、ゼブラフィッシュでは表皮細胞の膜電位がヒレの形態に影響を及ぼすことが示されていた。本研究ではこのメカニズムの解明を目指して、まず解析のためのツールとして表皮細胞の膜電位を人為的に操作する実験系の確立に取り組んでいる。膜電位を任意に操作するために、神経科学分野で利用されている光遺伝学技術をを導入することを計画した。光に応答して膜電位を上昇させるチャネルロドプシンと膜電位を低下させる機能を持つカリウムチャネルを同時に発現させることで、光照射によって表皮細胞の膜電位を大きく変化させ、ひいてはヒレの形態も操作可能になると考えている。この実験系を用いて、電気的シグナルを任意に操作することでヒレの形態を制御する分子機構を明らかにする。また、表皮細胞にも神経細胞のような電気的な活性があることが推測されてはいるが、実際の検出には未だ至っていない。そこで、表皮細胞での膜電位の変動を実際に検出するための観測系の構築にも取り組んでいる。検出感度を最優先に考え、まずは神経活動の検出にも使われているGCaMPを用いて細胞内カルシウム動態による間接的な検出を試みたところ、細胞内カルシウム濃度が激しく変動していることが観察された。さらには、細胞内カルシウム動態に関連した膜電位変動を検出するために電位プローブを用いた直接的観測にも取り組む。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①表皮細胞にチャネルロドプシンとカリウムチャネル（kcnk5b）を発現するトランスジェニックフィッシュを作成した。これらの魚を光照射下で飼育したところ、チャネルロドプシン単独で発現させた場合には光依存的にヒレの形態の変化が観察されたものの、カリウムチャネルとの2重トランスジェニックフィッシュではチャネルロドプシンの効果が十分に発揮されず、計画通りにヒレの形態変化を誘導することができなかった。
②表皮細胞での電気的活動を間接的に検出するために、細胞内カルシウムレポーターGCaMP6sを表皮細胞に発現するトランスジェニックフィッシュを作成した。この魚のヒレを切除後、再生する過程をライブイメージングにより観察した。再生芽の表皮ではランダムなスポット状にGCaMP6sレポーター活性が観察されたが、興味深いことに、それらスポットは短時間で発生と消滅を繰り返していた。
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| 今後の研究の推進方策 |
①現状の膜電位操作系の問題点として、光刺激時のチャネルロドプシンの効果がカリウムチャネルによる抑制効果を十分に上回ることができていないことが考えられる。この点を改善するため、まず第一にプロモーターを改良し、チャネルロドプシン自体の発現量を増やすことを試みる。また別の改善案として、カリウムチャネルを常時開口型のkcnk5bチャネルから、電位上昇時に閉口するkir2.1チャネルに変更することで、チャネルロドプシンの活性化時にカリウムチャネルが機能しないようにする。
②再生芽表皮で観察された細胞内カルシウム濃度変化が、膜電位の変動に伴うものであるのかどうかを検証する。人為的にチャネル機能を操作して表皮細胞の膜電位を変化させた場合に、それに伴ってGCaMP6sレポーター活性が変化することを確かめる。またASAP3やVoltronなどの膜電位プローブタンパク質を導入することで、表皮細胞の膜電位動態の直接的観測にも取り組む。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験系、観察系を構築するための条件検討を主に行なったため、解析のために申請していた予算をあまり使用しなかった。この分の予算は来年度、系が確立して実際の解析を行うようになった際に使用する。
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