| 研究課題/領域番号 |
20K06705
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
長谷 あきら 京都大学, 理学研究科, 教授 (40183082)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | フィトクロム / 分子種 / 舌構造 / N-PASドメイン / 光感度調節 / 避陰応答抑制 / 植物進化 |
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| 研究実績の概要 |
植物の光受容体フィトクロムにはフィトクロムA（phyA）とB（phyB）という機能が大きく異なる２つの分子種が存在する。植物は、祖先型のアミノ酸配列の一部を変化させ、この機能分担を実現した。しかしながら、具体的にどのアミノ酸残基がどのような機能に対応しているかは不明である。本研究では、phyAとphyBの配列を混ぜ合わせた分子を設計し、それらを植物に遺伝子導入して発現させ、その性質を調べることで、この謎の解明を目指した。
本年度は、我々がこれまでの解析結果に基づき、PHYドメイン内の舌構造について、アミノ酸置換変異体の解析を進め、１）過去に作出したphyA型からphyB型へのアミノ酸置換体の性質を再評価した。その結果、４つのphyA型アミノ酸残基がフィトクロムの光感度を増加させていることを示唆する結果を得た。２）以上を受け、phyB型のPHYドメインにおいて、当該の４アミノ酸を同時にphyA型へと置換したフィトクロムを２種構築し、シロイヌナズナのphyAphyB二重変異体に導入した。現在、形質転換系統の中から適度な発現レベルを示す株を選別し、後代において多数の種子を調製中である。
また、当初の計画に沿って温度応答と分子種の関わりを探る目的で生理実験を行ったが、その途中で偶然に、N-PASドメインがphyA型のキメラフィトクロムが、極端にR:FR比が低い条件下において避陰応答を抑制する活性を示すことを発見した。避陰応答の抑制活性は、過度の避陰応答にブレーキをかけるという意味で、生理生態学的に重要である。phyAがこの活性を示すことはすでに知られているが、これが、おもにN-PASドメインによって決定される性質であることは興味深い。現在、N-PASドメインがphyA型であるキメラフィトクロムについて、その性質を詳しく調べている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）phyA型からphyB型へのアミノ酸置換：既に作出ずみの9種のアミノ酸置換変異（phyA型からphyB型への変異）について、導入フィトクロムの発現量と胚軸伸長抑制活性を詳しく調べた結果、フィトクロムの光感度調節に４つのアミノ酸残基が関わること、どのアミノ酸置換の効果も部分的であり、複数のアミノ酸残基が加算的に関わること、などが示唆された。また、種子植物の各種フィトクロム配列を比較し、当該のアミノ酸残基が進化の過程でいつ獲得されたかを推定した。
２）phyB型からphyA型へのアミノ酸置換：phyA型からphyB型への置換によって光感度が低下することが確認されたため、逆にphyB型からphyA型へアミノ酸置換を行うことで光感度が上昇するかどうかを調べることにした。低感度タイプであるキメラフィトクロムBBBB（全てのアミノ酸残基がphy配列）およびABBB（N-PASドメインがphyA配列でそれ以外がphyB配列））について、舌構造内の上記４アミノ酸を同時にphyA型に置換したフィトクロム遺伝子を構築し、シロイヌナズナのphyAphyB二重変異体に導入した。現在、複数の候補系統からの絞り込みと、実験材料確保のための大規模栽培を進めている。
３）ABBBキメラフィトクロム（N-PASドメインをphyA型に交換したphyBフィトクロム）を発現する植物を調べたところ、R:FR比が低下するほど胚軸が短くなった。すなわち、ABBBにおいてphyAで知られていた避陰応答の抑制活性が再現された。そこで、各種生理実験を進め、長時間の光照射によってABBBは通常のPfr型とは異なる活性状態になることを示唆する結果を得た。一方、核内顆粒の形成については、照射時間の長短に関わらずphyBと同様の応答を示した。
以上のように、本研究は一部予想外の結果も含みつつ順調に進展した。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度においては、これまでの結果をまとめ論文として投稿する。以下の２つの論文を投稿する計画である。
１）phyA型のN-PASドメインに避陰応答を抑制する活性があることを発見した。そこで、これまでに得た実験結果をまとめ、原著論文として投稿する。
２）前年度に作出を進めたphyB型からphyA型へのアミノ酸置換変異体について、発現量や光応答の感度を詳しく調べる。予備実験の結果によれば、当該の置換変異体において光感度が上昇していることが確認されている。以上の結果を、phyA型からphyB型への置換変異体の結果と合わせ、原著論文として投稿する。このためには、まだ若干の実験が必要である。また、当該のアミノ酸残基について、種子植物の進化においてどのように変化してきたかを推定し、この内容も論文に加える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度に行う予定であったシロイヌナズナ形質転換系統の確立について、予備実験に計画より時間がかかったため、若干の遅れが生じたため、得られた形質転換系統の光応答の解析や、発現量の測定が次年度にずれ込んだ。また、N-PASドメインによる避陰応答抑制という予期されなかった結果が得られたため、これを補足する実験が若干必要である。
以上の理由で、次年度に若干の追加実験が必要となる。これには消耗品費が必要である。また、これらの結果をもとに当初の計画に従い原著論文2報を投稿する計画である。
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