| 研究課題/領域番号 |
20K06730
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
太田 啓介 久留米大学, 医学部, 教授 (00258401)
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| 研究分担者 |
広重 佑 久留米大学, 医学部, 助教 (50647782)
都合 亜記暢 久留米大学, 医学部, 技能職員 (80569517)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア / リン酸化 |
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| 研究実績の概要 |
ミトコンドリアは細胞の種類によって様々な独特の形を持っているが、その形がどの様に維持され、どの様にコントロールされているのかは明らかではない。我々はミトコンドリアがCCCP等の脱共役処理により、伸長したいわゆるミトコンドリアらしい長細い形から、球体(スフェロイド)、より正確には壺状へと急速に移行することを示してきた（Miyazono,2018)。この変形機序にリン酸化脱リン酸化が関わると予想し、その機構を明らかにすることが本研究の目的である。
本課題では、これまでにリン酸化・脱リン酸化阻害剤投与により、この形態変化に影響が及ぼされることを確認してきているが、現在、PINK1-perkinの系に注目し、PINK1のRNAiにより、その形態変化への影響を評価し、この系がミトコンドリア形態に及ぼす影響を評価している。
近年、パーキンソン病患者由来(PRKN遺伝子に異常が確認された）細胞において、CCCP処理によるスフェロイド形成が抑制されていることが報告されている(Yokota, Molecular Brain 58 (14)2021 ）。PRKNがコードするPerkinは、ミトコンドリアマイトファジーの系に関わる。脱共役にともなうPINK1のリン酸化とミトコンドリアへの集積によって初めてミトコンドリアにリクルートされることが知られており、これがマイトファジーを誘導する起点となる。PINK1-perkinの系はこのマイトファジーに関わるだけでなく、ミトコンドリア形態にも影響することを示唆するものであり、本課題で取り組んでいる結果とも密接に関わることが予想される。
ミトコンドリアの形は細胞種間で厳密にコントロールされているが、そもそもなぜ長細い、いわゆるソーセージのような形をしているのか、どうして細胞間で異なる形をしているのか、その本質は明らかになっていない。今回の結果はこれらの疑問に対して一つの答えにつながるものと期待している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年、条件の安定化に時間がかかっていたリン酸化阻害剤、脱リン酸化阻害剤の影響については昨年に引き続き行い、経路の絞り込みを進めている。ただ、反応が予想よりクリティカルではなく、候補遺伝子の確定に至らない可能性もある。しかし、関連する経路の推定ができるところまでは進められるよう計画している。
一方、iRNAについては、PINK１についてiRNAを作成し、培養細胞系においてその影響をテストをしている。発現量の抑制のチェック等を行いまとめている過程であり、継続中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNAiによる影響,また阻害剤による影響については、電子顕微鏡下での評価を目指し次年度当初から試料作製を行う。評価項目は、当初はLive-3D-CLEM法としていたが、反応が環境変化に対して鋭敏であることを鑑み、一定時間での固定時の状況判断とし、Live imagingは行わない方針に変更する。しかし、得られる結果に対しては当初予定とかわからない結論が得られるものと考えている。
一方、これに加え、より広範な解析ができる、SEM広域CLEM観察を予定する。今回の反応が、予想よりも明確ではないため、統計的処理が必要となると考えられるためである。広域CLEM法は、培養細胞を固定後、広範囲に光顕観察し、その構造を電子顕微鏡化に相関観察する方法で、我々の研究センターではその基本技術を既に確立している。これにより、微細形態の詳細を解析するもので、3D-CLEM法では達成できないn数を稼ぐことにより、統計的変化を捉えることで、本研究の目的達成を図る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
siRNAの種類を予定より少なくしたことに伴い、支出を減額した。一方で、次年度の電子顕微鏡解析は当初予定よりも、項目を増やす予定にしており、これに充当する予定である。
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