| 研究課題/領域番号 |
20K06737
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
櫻井 啓輔 筑波大学, 生命環境系, 助教 (20647317)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 視細胞 / オプシン / 網膜 / 錐体 / 桿体 |
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| 研究実績の概要 |
脊椎動物の視覚において明所視を担う錐体視細胞は、暗所視を担う桿体視細胞と比較して素早い光応答や順応特性を示す。一方で、錐体視視物質の分子特性も、桿体視物質と比較して速い光反応性を示すことが知られている。このような視細胞の光応答や順応特性に対して、各視細胞のオプシンの分子特性の違いがどのように関連するのかを解明する為に、錐体オプシンを改変したマウスモデルを用い光応答や順応特性の比較検証を行う。
本年度は、光反応の分子特性が桿体型に変化した錐体オプシン変異体が錐体視細胞に発現する遺伝子改変マウスの作製を試みた。遺伝子改変マウス作製は、マウス受精卵にCRISPR/Cas9による相同組換え修復により標的部位に変異を導入するノックイン法を用いた。得られた仔マウスの組織からゲノムDNAを抽出しPCRにより遺伝子型を解析した結果、マウス緑錐体オプシンの２００番目のプロリン残基がイソロイシン残基に置換された遺伝子組換え体が２個体得られた。これらの遺伝子改変マウス個体と野生型マウスを交配し、組換え体の生殖細胞系列への伝達の確認と系統の樹立を行っている。得られたマウスの視覚機能を電気生理学的に解析することにより、錐体視細胞の光応答や順応特性において錐体オプシンの特性が関与する生理学的役割が解明される。それに加えて、本研究で錐体オプシンへ導入したアミノ酸残基は錐体オプシンと桿体オプシン間でそれぞれ高度に保存されている残基のため、オプシン遺伝子の多様化の進化学的意義が明らかになると期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ゲノム編集溶液を生体内へ注入する技術、電気穿孔の刺激条件、ガイドRNAの設計等が最適化されていなかったため、ゲノム編集によるマウスモデルの作製を試みたが、当初計画していた期間内には組換え体が得られなかったため、進歩状況はやや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、遺伝子組換えマウスを野生型と交配させ系統の樹立を行う。また、既に得られた組換え体からF1世代の組換え体が得られない場合を想定し、並行して新たなF0マウスの作製を行う。F1世代マウスが得られた場合は、標的部位周辺のシークエンス解析や、錐体オプシン変異体の発現量や網膜における局在の解析を行う。また、ノックインマウスを桿体トランスデューシン欠損マウスやロドプシンキナーゼ欠損マウスと交配させた後、パッチクランプ法やex vivo Electroretinogram法を用いてマウス錐体視細胞の光応答特性を測定する。マウスの暗順応特性を調べるためにin vivo Electroretinogramを用いてマウス錐体視細胞の暗順応特性の解析を行う。
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