| 研究課題/領域番号 |
20K06774
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| 研究機関 | 上智大学 |
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研究代表者 |
安増 茂樹 上智大学, 理工学部, 教授 (00222357)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 遺伝子重複 / 機能進化 / 孵化酵素 / 卵膜分解 / 新規機能獲得 |
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| 研究実績の概要 |
遺伝子重複は進化の重要な原動力の一つである（Ohno 1979）。重複遺伝子が、どのように新規機能を獲得してきたかを解明することは、進化学において重要な課題である。真骨魚類の孵化酵素は、数回の遺伝子重複を経験している。その結果、分岐の早い魚では単一酵素の卵膜分解系であるのに対し、分岐の遅い正真骨魚では2種類の酵素（HCEとLCE）による共同作用により効率の良い分解系に進化した。研究の目的は、正真骨魚類で分岐の早いサケ目（ニジマス）とキュウリウオ目（アユ）の孵化酵素の卵膜分解機構を調べることでどのように2種の酵素系が成立したか考察することである。面白いことに、キュウリウオ目の魚は3つの酵素 (HCE, LCE, HE)を持つが、その後の進化過程でHE遺伝子は消失している。このことから、HCE-LCE系の成立過程で3つの酵素の分解系が存在したことが予想される。アユのリコンビナント孵化酵素を作成して単離卵膜を分解させると、rHCEとrLCEは効率が悪く、rHEがもっとも顕著に卵膜の軟化を引き起こす。このことは、アユのHEは、進化過程でHCE-LCEの卵膜分解系の成立を補助した酵素という仮説が浮かび上がる。2020年度では、アユのリコンビナント孵化酵素の作成と、それらを卵膜と保温して分解作用を調べた。分解物電気泳動の結果、rHEのみで複数の分解物のバンドが検出され、rHCEとrLCEでは高分子量のバンドのみ検出される。この結果は、HEが、効率よく卵膜が分解するという、以前の結果を追随するとともに、rHCEとrLCEとは異なった切断点を持っていると予想される。また、rHCEとrLCEは、合わせて作用させても効率の良い分解は起きないことから、HCE-LCEの分解系は、不完全といえる。以上の結果は、HCE-LCE分解が確立する過程を補助する遺伝子（HE）が存在するという仮説に矛盾しない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2020年度は、コロナ禍で、教員と大学院生共に研究を行う時間が制限された。研究課題の用いる手法は、酵素精製など生化学的手法で時間の要する実験が主になり、実験時間短縮により計画進行は、やや遅れている。また、活性の高いリコンビナント孵化酵素を得るため、リフォールディング法の改良を行っている。卵膜は、強固なタンパク質の構造物であり、市販のプロテアーゼでは分解されない。孵化酵素でも卵膜の構造変化を起こさせるには、活性の高い酵素標品が必要となる。酵素の卵膜切断点の決定とそれらの切断活性の測定に、より精度の高い結果を出すため、リフォールディング法の改良が必要となる。そのため、各酵素の卵膜分解物のN-末端配列決定は、次年度に行う。また、ニジマスのHEは、ゲノムに存在するが孵化腺細胞での発現は検出されない。ニジマスは、他の正真骨魚類と同様にHCEとLCEの２つの酵素系であると考えられる。ニジマスの分解機構を解明するため、ニジマスHCEとLCEのリコンビナントタンパク質を作成したが、活性のある酵素が得られなかった。現在、ニジマス孵化液より、両酵素の精製を試みている。現在、いくつかのカラムクロマトグラフィーを試み部分精製されているが、より純度の高い標品が必要である。以上のように、各研究計画において、若干の進行の遅れが生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請は、①アユとニジマスの卵膜分解機構の解明と、②変異リコンビナントタンパク質を作成して、孵化酵素の卵膜分解特異性の変化を調べることで、酵素の卵膜分解特性とアミノ酸変異とを結び付けることを目標としている。①のニジマス孵化酵素の精製と切断点の決定は、継続的に行う。アユにおいては、リコンビナント孵化酵素を用い切断点の決定後、切断点近傍配列のペプチドを合成して、各酵素の切断効率を調べる。それと並行して、②の変異タンパク質の作成に取り掛かる。Inverse PCR法を用い孵化酵素ｃDNAに変異を入れ、リコンビナント酵素を大腸菌で作成する。メダカのHCEとLCEの卵膜分解特異性に関与する4つのアミノ残基がわかっている。HCEの4残基をLCE型に変異させるとLCEの活性を持ち、逆にLCEをHCE型に変異させるとHCE用活性を持つ。一方、アユとニジマスのHCEとLCEでは、この4残基の保存性が低い。アユのHCEとLCEの4残基をメダカ型に変異させると卵膜分解活性がどのように変化するか、など複数の変異リコンビナント孵化酵素を作製して実験を行う。これらの実験と並行して、より高い活性のリコンビナント酵素を作成するためリフォールディング法の開発も行う。2021年度内に、ニジマス（HCE、LCE）とアユ（HCE,LCE,HE）の卵膜切断点の決定とペプチド基質を用いた切断効率の結果のデーターを揃え、HCEーLCE系の確立した新真骨魚類のHCE-LCEの分解系と比較し、HCEとLCEの機能進化過程を推測できるレベルまで発展させる。そのデーターを基にリコンビナント孵化酵素の変異部位の候補を決定していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画の進行状況で記載したように、コロナ禍により研究時間が短縮され、学会もリモートとなったため、消耗品等の実験にかかわる費用と旅費が減少した。今年度は、比較的順調に研究が進んでいる点と、今年度に予定しているアミノ酸配列決定の外注と基質ペプチドの合成にかかる費用が高額となることが予想される。これらを繰り越し予算として執行する計画である。
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