| 研究課題/領域番号 |
20K06834
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
鈴木 俊介 信州大学, 学術研究院農学系, 准教授 (30431951)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 転位因子 |
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| 研究実績の概要 |
研究計画のとおり、CDK5RAP2, MCT1/SLC16A1, TBC1D5 遺伝子座中のヒト特異的レトロトランスポゾンSVA F1を、CRISPR/CAS9システムによるゲノム編集より欠失させたヒトiPS細胞株の作出に取り組んだ。昨年度には、CRISPR/CAS9システムによるゲノム編集技術を用いて、iPS細胞以外の培養細胞では狙いどおりの欠失を引き起こすことができるガイドRNAを設計することができたが、ヒトiPS細胞を用いて同様の実験を行うと欠失が確認できないことが問題であった。遺伝子導入時に多数のiPS細胞が死滅していることが原因である可能性が考えられたため、アポトーシス抑制遺伝子BCL-XLをゲノム編集ベクターと一緒にトランスフェクションすると生存率が改善するという報告を利用した。また、以前条件検討を行って決定したエレクトロポレーションのパラメーター設定では、研究室移転後にトランスフェクション効率が低下していたことが明らかになったため、再度エレクトロポレーションの条件検討を行い再びスクリーニングを続けたところ、MCT1/SLC16A1遺伝子座においてヘテロ欠失株を取得することができた。薬剤選択をするとコロニーピックアップ後の生存率が30%程度に低下してしまうため、せっかく欠失が確認できた株が死んでしまうことがあるのが問題であるが、ひとまずヒトiPS細胞におけるCRISPR-delの系ができたため、今後、上記問題点の改善を試みながら各遺伝子座のSVA F1をホモで欠失した細胞株の作成に取り組む。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度に生じた、iPS細胞以外の培養細胞では狙いどおりの欠失を引き起こすことができるガイドRNAを使用しているにもかかわらず、ヒトiPS細胞を用いて同様の実験を行うと欠失が確認できないという問題の解決に取り組んだため。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度に生じた、iPS細胞以外の培養細胞では狙いどおりの欠失を引き起こすことができるガイドRNAを使用しているにもかかわらず、ヒトiPS細胞を用いて同様の実験を行うと欠失が確認できないという問題の解決に取り組み、ひとまずヒトiPS細胞におけるCRISPR-delの系ができたため、研究計画のとおり各遺伝子座のSVA F1をホモで欠失した細胞株の作成を急ぐ。その後、SVA F1の有無が神経系細胞におけるホスト遺伝子の発現にどう影響するかを明らかにするため、作出したそれぞれのSVA F1欠失ヒトiPS細胞および野生型ヒトiPS細胞、さらに元々SVA F1がないチンパンジー iPS細胞およびニホンザル iPS細胞を用いて神経系細胞への分化誘導実験を行い、分化に伴うホスト遺伝子の発現変化をリアルタイムPCRや免疫染色で解析し、比較することで、SVA F1は、 神経系細胞においてCDK5RAP2、MCT1/SLC16A1およびTBC1D5の発現を上昇させる役割を担うのかを明らかにする計画である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
最後に微小な残額が生じたため、翌年度分と合わせて使用する。
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