| 研究課題/領域番号 |
20K06857
|
|---|
| 研究機関 | 熊本大学 |
|---|
研究代表者 |
沼川 忠広 熊本大学, 発生医学研究所, 特定事業研究員 (40425690)
|
|---|
| 研究分担者 |
小高 陽樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (40831243)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | ライソゾーム病 / ミクログリア / ニューロン / 相互作用 / 中枢神経系 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究では、重篤な神経症状を呈するライソゾーム病であるGM1ガングリオシドーシスおよびシアリドーシスに着目し、ヒトニューロンおよびヒトミクログリアの共培養系の確立と、それを用いたそれぞれの疾患の細胞レベルでの病態解明を目指す。本年度、我々はGM1ガングリオシドーシスではプレシナプス機能が著しく低下しており、開口放出（神経伝達物質の放出）に係わるシナプス蛋白質の発現低下を報告したが（Kajihara R, Numakawa T, et al., Stem Cell Reports. 2020）、病態へグリア細胞がどのように寄与するかに関してはまったく不明であった。そこで、我々の報告したiPS細胞からの機能的ヒトニューロンを創出する培養系（樹立方法、Kajihara R, Numakawa T, and Era T., Bio Protoc. 2021）に対して、ヒトミクログリアを別個に作成し、ニューロン培養系にミクログリア添加を行った。そして、ニューロンの機能へのミクログリア共存の影響を解析した。この（健常ニューロン＋健常ミクログリア）における神経機能解析には、色素ＦＭ1-43を用いた開口放出のリアルタイムイメージングを行った。具体的には、十分に機能的になったday225日のニューロンに（培養初日は100000個/cm2）、ミクログリア（10000個）を加え、さらに5日および9日間培養した。解析の結果、ミクログリア添加5日後では開口放出機能が有意に減少したが、9日後にはこれが回復し、ニューロン単独及びミクログリア共存ニューロンでの神経機能に有意な差は見られなかった。これは非常に興味深い知見であり、健常ニューロンの機能に対してもミクログリアが積極的に関与していることを示唆しており、現在進行中であるライソゾーム病ニューロンへのミクログリアの関わりに興味が持たれる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒトiPS細胞から神経幹細胞を樹立し、そこから機能的なニューロンを創出するには少なくとも2カ月以上の時間を有するが(Kajihara R, Numakawa T, and Era T., Bio Protoc. 2021に発表)、我々は本年度、iPS細胞から卵黄嚢様の構造体を経て分化してくるミクログリアとの共培養系の確立に成功した。現在、GM1ガングリオシドーシスおよびシアリドーシスなどの疾患由来iPS細胞より作出したニューロンへのミクログリアの添加、およびその長期維持に取り組んでおり、進捗状況は概ね順調である。先行して本年度実施した、（健常ニューロン＋健常ミクログリア）の共存系において、プレシナプス機能の評価に強力であるFM1-43色素の利用により、ミクログリアのニューロンの機能に対する積極的な寄与を見出すことに成功した。これは、ヒトの中枢神経系におけるニューロン・ミクログリア相互作用を、定性的かつ定量的に測定することを可能にしたin vitroシステムの樹立を意味しており、既に進行中である疾患ニューロンの機能低下の健常ミクログリアによる是正効果などが確認されれば、ニューロン・ミクログリア相互作用における様々な新しい知見の獲得を予想させる。特にシアリドーシスニューロンでは、細胞内カルシウム動態などにも異常が見られ、これが細胞生存などにも重大な役割を果たすことを明らかにしつつあり、このカルシウム動態に対するミクログリアの寄与にもアプローチしている。当初の予想より、ニューロンの機能変化を適切に解析するには、維持日数が長期間必要であることが明らかになってきたが、in vitro解析システムとしては安定しており、今後、ライソゾーム病病態に関する新しい知見の蓄積を期待できる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
我々の研究で、GM1-ガングリオシドーシスニューロンでは、健常ニューロンと比べて、その培養下における分化そして生存率に有意な差がないことが明らかになった（Kajihara R, Numakawa T, et al., Stem Cell Reports. 2020）。健常、疾患群間において、樹状突起の長さにも差が見られなかった。ところが機能的な解析により、GM1-ガングリオシドーシスニューロンでは神経伝達物質放出に重要なエキソサイトーシスに著しい障害が見られた。本年度のミクログリアとの共存培養系にて、健常のニューロンおよびミクログリアの組み合わせではあるが、ミクログリアによるニューロンの機能抑制効果が観察された。実は、予備的な実験結果ではあるが、シアリドーシスニューロンなどでは、グルタミン酸受容体の機能亢進による可能性がある細胞内カルシウム動態異常が見出されている。カルシウムの異常は、活性酸素曝露に代表されるストレスへの脆弱性に直結する可能性がある。iPS細胞由来のヒトニューロンでは、少なくとも100日程度の長期培養にて明らかなカルシウム応答が観察されるが、今後の研究では特に、（健常ニューロン＋健常ミクログリア）、（健常ニューロン＋疾患ミクログリア）、（疾患ニューロン＋疾患ミクログリア）、（疾患ニューロン＋健常ミクログリア）、の組み合わせでのエキソサイトーシス機能の変化の方向性を明らかにし、カルシウム亢進/神経細胞死におけるミクログリアの寄与を見出すことに重点を置きたい。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
現在、GM1ガングリオシドーシスおよびシアリドーシスの疾患由来iPS細胞を用いて、比較的成熟したヒトニューロンに対して、ヒトミクログリア添加のタイミングや、その後の維持期間の検討を行っている。これは、健常ニューロンに対するミクログリアの共存期間の変化により、神経機能における違いが見出されたためである。
研究計画の後半では、ヒト大脳皮質様層構造を有するオルガノイドの作成と、これに対するミクログリアの共培養を試みる。大脳皮質様オルガノイドの作成においては、iPS細胞から卵黄嚢様の構造体を得る前段階のEmbryonic body(EB)作成が、ミクログリア作成と共通しているので既に実施中である。しかし、三次元構造体である大脳皮質様オルガノイドにおいてその発達段階のどのタイミングでミクログリアとの共存を開始するかは極めて重要である。これには、二次元の分散培養系での結果が重要なヒントとなり得る。そのため、研究初年度では、比較的コストのかからない二次元培養系での共培養系の確立、および解析が主となり、今後は3次元培養系も含めて培養や解析試薬に相応な研究費用が生じる予定である。このため、次年度使用額が生じた。
|
