| 研究課題/領域番号 |
20K06862
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
河村 寿子 (中山寿子) 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (70397181)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | シナプス刈り込み / シナプス再編成 / 視床 |
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| 研究実績の概要 |
2020年度には先ず、Kir2.1発現AAVまたはCre依存的Kir2.1発現AAVを用いて、VPmニューロンまたはPrV2線維の神経活動をシナプス発達期全体（生後8日目頃～21日目頃）にわたって抑制する実験を行った。その結果、VPmとPrV2の神経活動がシナプス強化と刈り込みに対して異なる様式で影響を及ぼすという結果を得た。先行研究から、生後12～14日目は臨界期として知られており、この時期にヒゲを抜去するとシナプス強化と刈り込みが障害されることが知られている。そこで、この臨界期とその前後の時期のVPmとPrV2の神経活動の役割を調べるため、AAVを用いて抑制性DREADDs（hM4D(Gi)）をVPmまたはPrV2に発現させ、生後8～19日目、8～11日目、12～15日目、16～19日目の各時期にCNOを腹腔投与して時期特異的に活動抑制を行う実験を計画した。現在までに、VPmの時期特異的活動抑制の実験を実施し、生後12～15日目にVPm神経活動を抑制した場合にのみ、シナプス強化と刈り込み両方が障害されるという結果を得た。また、生後8～11日目にVPmを抑制すると生後12～15日目のVPm抑制の影響が抑えられるという結果も得たことから、生後11日目以前のVPm神経活動が生後12日目からの臨界期プロセスに何らかの影響を与える可能性も見えてきた。PrV2にTeNTを発現させてDOX投与・非投与で時期特異的にPrV2からVPmへのシナプス伝達を阻害する実験に関しては、tetO-TeNT/EGFPマウス、Cre依存的tTA発現マウスを入手したものの、交配予定のKrox20-Creマウスにおいて脳幹以外におけるCre発現を抑えるようにKrox20-Creマウスを改良する必要性が生じたため一旦保留とした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2020年度は、生直後のマウス脳の標的部位にAAVウイルスを接種する実験条件を整え、視床VPmと脳幹PrVにKir2.1発現ウイルスを接種し、シナプス強化と刈り込みに対する影響を電気生理学的に評価する実験を遂行できた。また、時期特異的に活動操作するための実験として、計画立案時にはDOX発現誘導系を想定していたが、DOXによる発現制御に5日以上を要することを示す準備実験結果が得られたため、本研究には適用できないと判断した。代替え方法として、AAVベクターで抑制性DREADDsを発現させ、マウスへのCNO腹腔投与で時期特異的に活動操作できる実験系を立ち上げ、視床VPmニューロンの神経活動を4つの発達時期に分けて抑制する実験を実施した。また、Krox20-Creマウスの改良に関しても専門家に相談し、共同研究として進める方針を立てることができた。今年度は新型コロナウイルス感染症の影響で研究試薬や動物の入手などが一部滞ることもあり、当初の計画手法、順序に変更が生じたものの停滞してるとは言えず、研究計画全体としては概ね順調に進んでいると認識している。
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度は初年度に引き続き、DREADDシステムを用いてプレシナプスPrV2の神経活動を初年度と同様の4つの発達時期特異的に操作した場合に、シナプス強化と刈り込みがどのような影響を受けるかを電気生理学的に解析する。電気生理学的手法を用いてシナプス機能を解析する実験と並行して、視床VPm領域においてヒゲ感覚神経終末PrV2特異的にtdTomatoを発現する遺伝子改変マウスとVGluT2染色を組み合わせて、視床VPmまたは脳幹PrV2の神経活動を抑制した場合に残存するシナプス終末の由来がPrV2（ヒゲ）かnon-PrV2（ヒゲ以外か）を明らかにするための形態学的解析を行う。特に解析対象の画像取得については、最近研究室に導入されたキーエンス社製オールインワン顕微鏡を用いて高倍率の画像を複数枚連結させて広い視野の画像を短時間で取得することが可能になったため、視床VPmの広い領域を対象に解析する方針である。また、Krox20-Creマウスの改良についても専門家の協力を仰ぎながら進める方針である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2020年度は新型コロナウイルスの影響により、研究試薬、遺伝子組み換えマウス動物、海外からのAAVウイルスベクターの調達などが困難であり、また、関連研究者との密な研究打合わせなどが行えない状況であったため、当初の研究計画の手法および実施順に変更が生じた。そのため、当初予定していた備品と一部のAAVウイルスの購入や学会・研究会に伴う出張費の支払いを行えず、繰越金が生じた。繰越金は、2021年度の研究計画の遂行に必要な備品等の購入に充て使用する予定である。
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