| 研究課題/領域番号 |
20K06890
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
白崎 竜一 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (40423149)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 神経回路形成 / 軸索ガイダンス / プルキンエ細胞 / 小脳核ニューロン / 核内受容体 / 遺伝子発現制御 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、小脳プルキンエ細胞の軸索が構築する小脳出力回路の形成過程を、胎生期のマウスの個体レベルで明らかにするとともに、プルキンエ細胞選択的に発現している核内受容体RORaの役割に焦点をあてることで、その回路形成を制御している分子機構の一端に迫ることを目指している。本年度は、昨年度までに明らかにした小脳プルキン細胞の軸索発達とその伸長パターンの基礎データをベースとして、プルキンエ細胞軸索の回路形成における核内受容体RORaの役割を明らかにすることを目指した。そのためにまず、プルキンエ細胞の軸索伸長期においてRORaの機能を阻害させるために、RORaの優性型機能阻害変異体（DN-RORa）をプルキンエ細胞で強制発現させる実験を行い、回路形成への影響を個体レベルで解析した。また、RORaを本来発現していない小脳核ニューロンに対して、RORaを強制発現させるGain-of-function実験を行い、その時の小脳核ニューロンの軸索伸長パターンへの影響を調べた。尚、これらの一連の解析は、プルキンエ細胞または小脳核ニューロン選択的にGFPで可視化された細胞を、その細胞体から軸索の先端である成長円錐までを連続的に把握することを可能とさせる後脳２次元展開標本と3D蛍光イメージング技術を組み合わせて行われた。その結果、DN-RORaが導入されたプルキンエ細胞の軸索伸長パターンについては、標的細胞である小脳核ニューロンや前庭核ニューロンへ向かう軸索伸長パターンに顕著な異常表現型を認めることができなかった。また、RORaを強制発現させられた小脳核ニューロンの軸索伸長パターンにも顕著な異常表現型が見られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和２年度において、小脳プルキンエ細胞の軸索伸長過程と標的認識過程をマウスの個体レベルで詳細に明らかにすることに成功し、本研究課題の推進に必須となる重要な基礎データが得られた。さらに令和３年度では、その基礎データをベースとして、プルキンエ細胞軸索の回路形成における核内受容体RORaの役割を、マウスの個体レベルで検討した。現在の解析初期段階においては、RORaの機能阻害による大きな異常表現型を呈する結果は得られていないが、概ね当初からの計画通りに研究が進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和３年度においては、令和２年度に明らかにした小脳プルキン細胞の軸索発達とその伸長パターンの基礎データをもとにして、プルキンエ細胞軸索の回路形成における核内受容体RORaの役割を個体レベルで明らかにする実験をスタートさせた。昨年度の解析初期段階においては、RORaの機能阻害によって、プルキンエ細胞の軸索伸長パターンへの大きな異常を引き起こすような表現型は認められなかった。そこで令和４年度は、プルキンエ細胞軸索による回路形成の局面の中でも、標的認識過程に焦点をあてて、RORaの回路形成への役割を明らかにすることを目指す。また、RORaの機能阻害実験については、昨年度実施した優性型機能阻害変異体（DN-RORa）を導入する実験の他に、ゲノム編集技術のCRISPR/Cas9による遺伝子ノックアウト実験も行い、その表現型も解析する。一連の表現型解析は既に確立させているプルキンエ細胞選択的な可視化技術によって進める。
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