| 研究課題/領域番号 |
20K06898
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
斉藤 治美 京都大学, 高等研究院, 特定助教 (20311342)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 大脳皮質視覚野 / 神経回路 / エンハンサー / 大脳基底核 / 線条体 |
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| 研究実績の概要 |
霊長類には多くの未知の高次脳機能があり、他の哺乳類と比較するとより複雑な神経回路網を形成している。本研究の目的は高等動物の脳内でどのような情報処理が行われるか、その動作原理を回路レベルで解析することが飛躍的に進められるために遺伝子導入によって脳内機能を細胞種特異的に解析するツールを開発することにある。視覚は霊長類への進化の過程で最も発達してきた感覚器であり、外界の環境を認知する上で非常に重要な役割を果たしている。大脳皮質第１視覚野内では様々な物質の特徴に対して、各々の細胞種が、長さ、空間周波数、色など、選択的な反応性を示すため、霊長類独自の高次脳機能の理解に適している。よって、今回は、まず、マカクザルの第１視覚野において、
１）細胞種特異的に遺伝子の転写を促すプロモーターやエンハンサーを同定し、これを用いて、細胞種特異的なターゲッテイングを行う事を目標に、マカクザルの第一視覚野（V1）におけるCAGE遺伝子ライブラリーを作成し、前頭葉（PFC）と比較検討の元、V１にのみ特異的に発現する遺伝子、更にV1において層特異的に発現する遺伝子を検出することができた。
次に、
２）第一視覚野の盲点領域において充填知覚に関する解析を行う為に、マルチ電極アレイによってV1の盲点領域の各層に局在する複数の細胞種の局所フィールド電位、ユニットの活動電位を同時記録し、充填知覚時にみられる神経活動を時間的・空間的に解析した。その結果、盲点領域において網膜からの直接の情報を受け取らない状況でも、高次視覚野からのフィードバック信号が第2、5層に局在する神経細胞群に伝えられ同期し、物体の形状に依存的な大きな受容野を形成することが分かった。このことは、視覚野でどのように視覚情報が再構築されているのかを理解する上で重要な知見であり、現在、研究成果を論文に発表する準備を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに、V1から、細胞種に選択的に転写を促すシス・エレメントを同定することを目的にCAGEライブラリーを作製し、V1、PFCに特異的に発現する遺伝子を同定することが出来たが、１）領野及び層特異的に発現するシス・エレメントの候補遺伝子の数は無数で、スクリーニングの為の候補遺伝子を選定することが困難であった。そのため、今後、特定の機能を持つ神経細胞に対してSingle cellライブラリーを作製し、対象となる遺伝子を絞り込む必要がある。また、２）大規模のエンハンサー・プロモーターのスクリーニングを行う為には、特定の機能遺伝子を用いて細胞種選択的なシスエレメントを網羅的に解析し、霊長類における脳内遺伝子の転写制御機構を理解すると共に、効率的なスクリーニングの方法を確立する必要があるという課題が見つかった。
2021年度はまず、２）の課題に対し、脳内機能の調節機構としての中核となる線条体において直接、間接経路を形成するヒトのドーパミンD1、D2受容体遺伝子の上・下流領域を解析し、これらの構成要素に特異的に遺伝子発現を促すエンハンサー遺伝子の同定を試みた。エンハンサー候補遺伝子のの選択は、オープンクロマチンの指標であるAssay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing（ATAC-seq）のデータベースを用いて行った。各々のエンハンサー候補遺伝子はアデノ随伴ウイルス（AAV）に組み込み、マウスの全脳において細胞種特異的性を解析しており、成果が出始めている為、今後、マカクザルの線条体においても解析することを計画している。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒトにおいて多くの精神疾患に関わる線条体において、細胞種特異的エンハンサーの同定及び遺伝子導入のシステムを確立することは、非常に重要な課題である。よって今後も更に、網羅的にエンハンサーのスクリーニングを行う。スクリーニングを行うにあたって、１ 霊長類にのみ相同性を持つエンハンサーは霊長類の線条体でのみ機能を有するのか？ ２ 複数のエンハンサーが組み合わせによって細胞種特異的な転写を促しているのではないか？という2つの問いに留意して実験計画を立て進めている。
次に、視覚野における階層的な情報処理に線条体からの情報がどのように関わり、視覚認知機能や価値判断に影響を及ぼすのかを明らかにするために、１）マカクザルの線条体、及び視覚野においてカルシウムイメージングを行えるよう、環境を整備、実験器具をセットアップする。２）マカクザルを用い、線条体内で細胞種特異的に遺伝子導入を行い、直接・関節経路を人為的に活・不活化するシステムを作製する。３）カルシウムイメージングから得られた情報から特定の細胞を採取し、遺伝子を同定する実験系を確立する。
以上の項目を2022年度に遂行する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2022年度においてマカクザルを用いた実験セットアップに一定の研究資金を投入する必要がある為、本研究資金はそのために繰り越し申請を行った。2021年度は、玉川大学から京都大学に移籍し、研究機関から支給されたスタートアップ資金を使用することによって、エンハンサーのスクリーニングに必要な機器、備品を整えることが出来た。
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