| 研究課題/領域番号 |
20K06924
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
渡部 美穂 浜松医科大学, 医学部, 助教 (10399321)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 生殖 / GnRHニューロン / GABA / オシレーション / 視床下部 / KCC2 |
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| 研究実績の概要 |
GnRHニューロンは視床下部に散在するにもかかわらず、排卵や卵胞成熟を引き起こすGnRHの大量分泌やパルス状分泌を起こすメカニズムは明らかにされていない。多数のGnRHニューロン間で活動が同期することがGnRH分泌様式の基盤となる可能性を検討した。Ca2+イメージング法によりGnRHニューロンの活動の指標としてCa2+オシレーションを記録するために、GnRHニューロンでtTA(テトラサイクリン制御性トランス活性化因子)を発現するGnRH-tTAマウスとβアクチン遺伝子の下流にtetO-GCaMP6fがノックインされているtetO-GCaMP6fマウスを交配させ、GnRH-tTA::tetO-GCaMP6fマウスの作成を行った。このマウスではドキシサイクリン投与中止で、GnRHニューロンでカルシウムセンサーであるGCaMP6fが発現されることを確認できた。このマウスより急性脳スライス標本を作成し、GnRHニューロンで活動に伴い細胞内Ca2+が上昇することを確認した。しかし、GCaMP6fの発現が弱かったため発現量を増やすために、マウスのホモ化を行っている。また、同期活動におけるGnRHニューロンへの興奮性GABA入力の役割を検討するために、GnRH-tTA::tetO-GCaMP6fマウスとKCC2-tetOマウスを交配させ、GnRH-tTA::tetO-GCaMP6f::KCC2-tetOマウスの作成を行った。このマウスではGnRHニューロンでGCaMP6fとGABA作用を抑制性に維持するカリウム-クロライド共輸送体(KCC2)が発現されることを確認できた。Ca2+イメージングにより得られたGnRHニューロンでのCa2+上昇の頻度、GnRHニューロン間での同期性などのデータのMATLABを用いた解析を共同研究者の協力で行うことができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定であるGnRHニューロンの活動の指標としてCa2+オシレーションを記録するための、GnRHニューロンでGCaMP6fを発現する遺伝子改変マウスを作成することができた。また、GnRHニューロンへのGABA入力を興奮性から抑制に変化させた時のCa2+オシレーションの同期性の変化を調べるための、GnRHニューロンでGCaMP6fおよびKCC2を発現する遺伝子改変マウスを作成することができた。これらのマウスのGnRHニューロンより、Ca2+オシレーションを記録し、記録したCa2+オシレーションの解析方法を確立することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、栄養状態の低下により生殖機能が低下した時に、GnRHニューロンが示すCa2+オシレーションおよびその同期性に変化がみられるか調べる。また、栄養状態の低下によりGnRHニューロンの細胞内クロライド濃度維持機構が破綻し、GnRHニューロンのGABA応答が興奮性から抑制性に変化し、同期性に変化が起こるか検討する。さらに、GnRHニューロンでKCC2を発現させたマウスを用いて、GnRHニューロンへのGABA入力を興奮性から抑制性に変化させた時、Ca2+オシレーションおよびその同期性に変化がみられるか調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
遺伝子組換えマウスを使用しており、繁殖が悪い時期があったため、マウス飼料代が次年度使用額となった。来年度のマウス飼料代として使用する計画である。
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